[發明專利]一種奶牛隱孢子蟲的快速檢測方法及檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201610225012.3
• 申請日: 2016-04-12
• 公開（公告）號: CN105734150A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 周東輝;吳耀東;徐民俊;鄭文斌;宋慧群;朱興全
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/10
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 呂玉博

1.一種奶牛隱孢子蟲的快速檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括以下成分：月桂酰肌氨酸鈉水溶液，吐溫-20水溶液，引物探針混合液，PBST溶液，測流層析試紙條，RPA凍干酶和RPA反應預混液；

所述引物探針混合液中引物序列為：

上游引物：5'-CTATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG-3'；

下游引物：5'-biotin-CCTCCAATTGATACTTGTTAAGGGGTTTATAC-3'；

探針序列為：5'-FAM-ACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCG-THF-GCAAATTACCCAATCCT-SpacerC3-3'；

所述PBST溶液的制備方法為：將1ml的吐溫-20溶于1000mlPBS溶液中，混勻即可。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：每16μl所述引物探針混合液的制備方法為：將上游引物21pmol，下游引物21pmol，探針6pmol混合于16μl純水中。

3.奶牛隱孢子蟲的快速檢測方法，所述檢測方法不以疾病的診斷和治療為目的，其特征在于：步驟如下：

（1）將奶牛糞便溶解于裝有月桂酰肌氨酸鈉水溶液的容器中，將容器放入盛有沸水的鍋中，蓋上鍋蓋，利用沸水的余溫孵育10-20分鐘，之后在容器內加入吐溫-20，使溶液中吐溫-20的濃度為5%-10%，得到含有隱孢子蟲DNA的樣品處理液；

（2）對樣品處理液進行重組酶聚合酶擴增；擴增時所使用的引物和探針為：

上游引物：5'-CTATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG-3'；

下游引物：5'-biotin-CCTCCAATTGATACTTGTTAAGGGGTTTATAC-3'；

探針為：

5'-FAM-ACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCG-THF-GCAAATTACCCAATCCT-SpacerC3-3'；

（3）將擴增產物滴加到測流層析試紙條上進行檢驗，如果試紙條為兩條杠，則為隱孢子蟲陽性，如果為一條杠，則為陰性。

4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于：步驟（1）中所述月桂酰肌氨酸鈉水溶液的質量百分比濃度為0.1%-0.2%。

5.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于：步驟（2）中所述重組酶聚合酶擴增的反應體系為：樣品處理液2μl，引物探針混合液16μl，RPA反應預混液32μl，RPA反應凍干酶一份；反應條件為：在30℃-45℃條件下反應20-30分鐘。

6.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于：步驟（3）中將擴增產物滴加到測流層析試紙條上進行檢驗的具體方法為：用無菌棒沾取少許擴增產物與200μlPBST溶液混勻，然后沾取一滴混合液滴加到測流層析試紙條的加樣端，并將加樣端豎直浸入裝有200μlPBST溶液的離心管中，數分鐘后觀察結果；

所述PBST溶液的制備方法為：將1ml的吐溫-20溶于1000mlPBS溶液中，混勻即可。

7.權利要求1或2所述的試劑盒在檢測奶牛隱孢子蟲中的應用，所述檢測不以疾病的診斷和治療為目的。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于：所述奶牛隱孢子蟲為感染奶牛的微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和瑞氏隱孢子蟲。

9.一種從奶牛糞便中提取隱孢子蟲DNA的方法，其特征在于：步驟如下：將奶牛糞便溶解于裝有月桂酰肌氨酸鈉水溶液的容器中，將容器放入盛有沸水的鍋中，蓋上鍋蓋，利用沸水的余溫孵育10-20分鐘，之后在容器內加入吐溫-20，使溶液中吐溫-20的濃度為5%-10%，完成奶牛糞便中隱孢子蟲DNA的提取。