[發明專利]一種雙拷貝人p53基因重組腺病毒及其制備方法

有效

• 申請號: 201610224992.5
• 申請日: 2016-04-12
• 公開（公告）號: CN105755043B
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 高貴;光煒
• 申請（專利權）人: 高貴;光煒
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N7/01;A61K38/17;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 劉慧娟;李馨

本發明公開一種雙拷貝人p53基因重組腺病毒及其制備方法，其通過選用已商品化的5型重組復制缺陷性腺病毒構建體系(AdEasy)，插入如SEQ ID NO.1所述的雙拷貝人p53腫瘤抑制基因真核表達盒，構建p53腫瘤抑制基因重組腺病毒表達載體系統，進一步得到表達雙拷貝人p53腫瘤抑制基因的重組復制缺陷型腺病毒顆粒。實驗證實其感染腫瘤細胞后，高效表達其攜帶的p53腫瘤抑制基因。因該病毒整合了雙拷貝p53腫瘤抑制基因真核生物基因表達盒，故將大大增加和增快p53腫瘤抑制基因表達量同時可減少病毒用量達到更好的基因治療效果。特異性強且廣譜，直接針對腫瘤細胞的基因突變，可用于各種組織類型的早中晚期惡性腫瘤。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種雙拷貝人p53基因重組腺病毒及其制備方法。

背景技術

正常組織細胞由于長期累積的基因突變而發展成為惡性腫瘤細胞，惡性腫瘤細胞的特征是不可控制的無限性生長、破壞局部和轉移部位的組織結構。治療腫瘤的最終目的是完全殺死或去除腫瘤組織。傳統治療腫瘤的方法包括手術、化療和放療三大主要方法和一些輔助療法，這些治療方法都有顯著的副作用和局限性。基因治療是目前發展起來新的抗腫瘤治療方法，直接針對腫瘤細胞的基因紊亂而治根。

P53基因是最重要的抑癌基因。當細胞基因體受到損傷后，p53基因表達的p53蛋白增強，發揮抑制細胞生長和引起細胞凋亡的功能。P53通過以下機制發揮治療惡性腫瘤的作用：腫瘤細胞G1期抑制并使腫瘤細胞停止生長、誘導腫瘤細胞自殺或凋亡、抗腫瘤血管生成、提高化療療效、提高放療療效、旁觀者效應，即P53的抗腫瘤作用會擴散到周圍的腫瘤細胞。

公開號為CN1471977A的專利公開了一種“治療增生性疾病的腺病毒載體與p53基因的基因重組藥物”，其抗腫瘤的基因產品重組人p53腺病毒注射液(商品名為)是一種經基因工程改造、具有感染活性的重組人p53基因腺病毒顆粒(rAd-p53)，由復制缺陷性人類5型腺病毒和正常的p53腫瘤抑制基因兩部分組成，復制缺陷性腺病毒顆粒作為載體把p53基因帶入腫瘤細胞，p53基因在腫瘤細胞內表達為p53蛋白發揮抗腫瘤的生物學功能。在2004年已被中國國家食品藥品監督管理局(SFDA)批準(批準文號：國藥準字S20040004)，經局部瘤內注射方式用于鼻咽癌的臨床治療，是世界上第一個上市的腫瘤基因治療藥物。

五型腺病毒為常用基因載體，載體將目標基因導入靶細胞內，表達為生物活性蛋白而發揮作用。腺病毒載體的優點是無論細胞處于生長期還是靜止期，都能高效轉染，傳遞基因；且不整合病毒DNA到宿主細胞基因組故不產生插入失活或誘變；腺病毒載體安全性好；滴度高，大批量工業化生產工藝成熟。腺病毒的E1區編碼病毒復制蛋白，去除E1區后，腺病毒變成復制缺陷型腺病毒，失去在細胞內復制的能力，所以安全性增加；E3基因表達的蛋白能對抗宿主的抗病毒防御系統，E3區的去除不影響病毒復制且能減少宿主的體內免疫反應。

發明內容

本發明為解決上述技術問題所采用并予以公開的技術方案是，應用分子克隆技術，將具有對于各種腫瘤治療作用的雙拷貝人p53基因重組腺病毒表達盒序列與具有轉染導入靶細胞內的5型重組腺病毒載體進行融合，獲得基因重組藥物。其特征是該基因藥物為一種雙拷貝人p53基因重組腺病毒，即作為基因治療用的高表達人p53腫瘤抑制基因重組腺病毒。構建技術路徑是選用已商品化的5型重組復制缺陷性腺病毒構建體系(AdEasySystem)，插入合成的雙拷貝人p53腫瘤抑制基因真核表達盒，構建p53腫瘤抑制基因重組腺病毒表達載體，進一步得到高表達雙拷貝人p53腫瘤抑制基因的重組復制缺陷型腺病毒顆粒。該腺病毒構建體系涉及兩個質粒載體：克隆目的基因的穿梭質粒(pShuttle)和復制缺陷型5型腺病毒基本骨架重組載體(pAdEasy)，該載體體系可插入攜帶7.5kb的外來基因。

1.穿梭質粒(pShuttle)除含有多克隆位點，以便插入目的基因片段外，還含有5型腺病毒啟動子，腺病毒包裝信號序列以及用于同源重組的腺病毒兩側同源序列(載體DNA序列參見NCBI基因庫，AF334399；GI:12698892)。