[發明專利]黑色素瘤易感基因檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201610221286.5
• 申請日: 2016-04-11
• 公開（公告）號: CN107287281A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 翟紅利;張淑敏;楊小平;史文華;趙明;徐冬雪;高艷;李冰;劉慧萍
• 申請（專利權）人: 山東國際生物科技園發展有限公司;煙臺賽澤醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種黑色素瘤易感基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估黑色素瘤發病的風險級別。

背景技術

惡性黑素瘤是由皮膚和其他器官黑素細胞產生的腫瘤。皮膚黑素瘤表現為色素性皮損在數月或數年中發生明顯改變。雖其發病率低，但其惡性度高，轉移發生早，死亡率高，因此早期診斷、早期治療很重要。惡性黑素瘤大多發生于成人，巨大性先天性色素痣繼發癌變的病例多見于兒童。

經過基因連鎖、細胞遺傳學、腫瘤細胞的雜合子丟失研究，推測在染色體9p21區域存在惡性黑色素瘤易感性基因。若家庭內有黑色素瘤患者，那么其發生黑色素瘤的相對危險與無家族史者比是2－3，已經發現有黑色素瘤家譜。黑色素瘤在家族中聚集雖然不常見，與大家族黑色素瘤有關的基因可能在普通人群為基礎的黑色素瘤中僅起很小的作用。在黑色素瘤家族中已經發現兩個基因，CDKN2A和CDK4，分別位于9和12號染色體上。在世界范圍內的家族性黑色素瘤有高達25％的CDKN2A基因突變，而CDK4僅見于幾個罕見家族。CDKN2A轉錄外顯子1a、2、3區域編碼p16蛋白，該蛋白能抑制細胞周期蛋白D1與CDK4或CDK6復活體的激活。而上述復合體的作用是參與視網膜母細胞瘤蛋白的磷酸化，使細胞跨過細胞周期的G1期，由于p16蛋白對上述復合體具有抑制作用，所以就可以通過下調細胞周期而抑制腫瘤。普通人群p16突變頻率估計為0.01％。

綜上所述，鑒于CDKN2A基因在家族性黑色素瘤變過程中有著不可忽視的作用，可以將其作為遺傳易感因素來檢測是否發生突變，及時篩查出易患黑色素瘤的高危人群，從而有針對性的預防和治療黑色素瘤，這對于降低黑色素瘤的發病率有非常重要的意義。

發明內容

基于本發明提供一種黑色素瘤易感基因檢測試劑盒。試劑盒檢測CDKN2A基因外顯子1a、2序列是否發生突變，可作為評估黑色素瘤發病的危險因子的基礎。

本試劑盒包括檢測CDKN2A基因外顯子1a和外顯子2序列的特異性擴增引物對及DNA測序引物；PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH2O)；

本發明試劑盒的組分和含量包括：10×PCR反應緩沖液300ul；2.5mM dNTP混合液 300ul；5U/ul Taq DNA聚合酶30ul；10uM特異性引物對(每條引物各150ul)；ddH2O 2ml

本試劑盒供一百人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20℃。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。

除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1

步驟1：抽提DNA模板，利用商品化的試劑盒提取受檢者基因組DNA。

步驟2：PCR擴增反應

使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物：

SEQ.ID NO.1：5'TGTGGGCAGGCTGTGGTT3'

SEQ.ID NO.2：5'CTCCCATATTGGGGCCTGCA3'

SEQ.ID NO.3：5'TGACCTTGCGGGACCTTAG3'

SEQ.ID NO.4：5'CCAAGACCCTTTCACTCCTATC3'

PCR擴增的反應體系為：10×PCR反應緩沖液2.5ul；2.5mM的dNTP混合液2ul、5U/ul Taq酶0.2ul、DNA模板20ng左右、10uM正向引物反向引物各1ul、添加去離子水至25ul；

PCR擴增的反應條件為：95℃5分鐘變性和酶激活，94℃30秒變性，55℃45秒退火，72℃2分鐘延長，循環35次，最后72℃延長10分鐘。

步驟3：PCR擴增產物純化，利用商品化的試劑盒對擴增產物進行純化。

步驟4：DNA測序反應，按照DNA片段測序的標準操作進行測序和分析，依據所有測序峰圖最終分析目的基因片段的序列。

步驟5：基因型分析

熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點的基因型。

實施例2.