[發明專利]黑色素瘤易感基因檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201610221286.5
• 申請日: 2016-04-11
• 公開（公告）號: CN107287281A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 翟紅利;張淑敏;楊小平;史文華;趙明;徐冬雪;高艷;李冰;劉慧萍
• 申請（專利權）人: 山東國際生物科技園發展有限公司;煙臺賽澤醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測黑色素瘤易感基因突變的引物，其特征在于，包含如下擴增引物組和測序引物：

1)擴增引物：

SEQ.ID NO.1：5'TGTGGGCAGGCTGTGGTT3'

SEQ.ID NO.2：5'CTCCCATATTGGGGCCTGCA3'

SEQ.ID NO.3：5'TGACCTTGCGGGACCTTAG3'

SEQ.ID NO.4：5'CCAAGACCCTTTCACTCCTATC3'

2)測序引物：

SEQ.ID NO.5：5'AAGAGGAGCGGAGCGGCTTT 3'

SEQ.ID NO.6：5'CACCCTGGCTCTGACCATTC 3'。

2.根據權利要求1所述的檢測黑色素瘤易感基因突變試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTPs、4條擴增引物、2條測序引物；所述4條擴增引物其序列如SEQ.ID NO.1-SEQ.ID NO.4所示，其中SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2、SEQ.ID NO.3和SEQ.ID NO.4分別用于CDKN2A基因1a、2號外顯子片段的擴增；所述2條測序引物其序列如SEQ.ID NO.5、SEQ.ID NO.6所示，其中SEQ.ID NO.5、SEQ.ID NO.6分別用于CDKN2A基因1a、2號外顯子片段的測序。

3.根據權利要求2所述的檢測黑色素瘤易感基因突變的試劑盒，其特征在于：所述DNA聚合酶的酶活力單位濃度為5U/uL，具有耐熱性能；所述PCR緩沖液是由pH＝8.2的100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KCl和10mmol/L MgCl2組成；所述dNTPs是由dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mmol/L混合而成的；所述擴增引物的濃度均為10umol/L。

4.一種利用權利要求2-3中任一項所述試劑盒的檢測黑色素瘤易感基因突變的方法，其特征在于所述方法的步驟如下：

1)樣本采集和基因組DNA提取：采集或取出待測生物樣本，利用商品化的試劑盒提取其基因組DNA；

2)CDKN2A基因特定片段擴增：采用所述試劑盒分別配制CDKN2A基因外顯子組合的擴增體系2管；每管擴增體系除了擴增引物不同外其余均相同，引物包括以下組合：第1管體系包含SEQ.ID NO.1-SEQ.ID NO.2擴增引物；第2管體系包含SEQ.ID NO.3-SEQ.ID NO.4擴增引物；對于25uL體系具體為2.5uL的10×PCR緩沖液，2uL的dNTPs，每條擴增引物1uL，0.2uLDNA聚合酶，20ng基因組DNA，最終添加滅菌去離子水補足至25uL；擴增條件均為：95℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，循環35次；72℃終延伸10min；

3)目的基因片段的割膠回收：所有的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在1ug/ml的EB溶液 中染色10min并用清水脫色后置于凝膠成像系統上拍照和分析，以DNA Marker條帶為標準，選擇正常體系中各外顯子擴增產物濃度不低于10ng/uL的條帶進行割膠，并用商品化的凝膠純化試劑盒進行回收；

4)目的基因片段序列測定：對于割膠回收產物，按照DNA片段測序的標準操作進行測序和分析，依據所有測序峰圖最終分析目的基因片段的序列；

5)突變結果判定和應用：通過對受檢者基因序列的分析，出具黑色素瘤易感基因風險評估分析報告單。該試劑盒包括檢測CDKN2A基因第1a，2號外顯子上的SNP位點信息以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據受檢者的風險級別，并由醫師向受檢者詳細說明和解讀黑色素瘤易感基因檢測報告單。