[發明專利]高效液相色譜串聯質譜技術檢測唾液中孕酮和睪酮的方法

有效

• 申請號: 201610220196.4
• 申請日: 2016-04-11
• 公開（公告）號: CN105675788B
• 公開（公告）日: 2017-12-19
• 發明（設計）人: 劉勝敏;何健;宋曉濤
• 申請（專利權）人: 北京洛奇臨床檢驗所股份有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 北京高文律師事務所11359
• 代理人: 徐江華,趙銳

技術領域

本發明涉及唾液檢測的技術領域，特別涉及一種高效液相色譜串聯質譜技術檢測唾液中孕酮和睪酮的方法。

背景技術

目前常用的檢測唾液中孕酮和睪酮的方法有酶聯免疫法、電化學發光免疫法等，這些方法受到多種客觀條件的影響，如溫度、pH值、離子強度、試劑免疫活性等。免疫法不可避免唾液基質中結構相似物質的干擾，靈敏度低。不同廠家生產的試劑盒檢測結果偏差較大，缺乏統一標準，導致檢測結果偏差較大，參考價值較低。

發明內容

本發明的目的是解決現有唾液中孕酮和睪酮檢測方法技術中存在的部分問題，提供一種高效液相色譜串聯質譜技術檢測唾液中孕酮和睪酮的方法及試劑盒。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種高效液相色譜串聯質譜技術檢測唾液中孕酮和睪酮的方法，包括如下步驟：

采用高效液相色譜串聯質譜技術檢測經過預處理的唾液中孕酮和睪酮，利用高效液相色譜將孕酮和睪酮與雜質分離，再利用同位素內標法定量，以標準品與內標物的濃度比為X軸，標準品與內標物峰面積比為Y軸，建立校準曲線，計算孕酮和睪酮的含量；

(1)具體色譜條件為：

流動相A：體積比為0.05％的甲酸水；

流動相B：甲醇，純度為色譜純；

色譜柱型號：Phenomenex Kinetex-C18，50×2.1mm，2.6μm；

采用梯度洗脫的方式，見表1；

流速為0.2ml/min，柱溫為40℃，進樣體積為20μl；

表1流動相梯度洗脫參數

(2)質譜條件：

在電噴霧電離正離子檢測模式下，采用多反應監測的質譜掃描模式；噴霧電壓為5000V；碰撞氣為6；氣簾氣為10；離子源氣流GS1為50，GS2 為50；離子源溫度為500℃；同時監測目標物孕酮m/z 315.3→109.1、睪酮 m/z 289.3→109.1、同位素內標d9-孕酮m/z 324.4→100.1；孕酮和睪酮及內標的去簇電壓、碰撞電壓、碰撞能和碰撞池出口電壓參數見表2；

表2孕酮和睪酮及內標的質譜參數

。

優選地，所述經預處理的唾液按照如下方法制備得到：取唾液500μl于 2ml離心管中，加入50ng/ml內標溶液10μl，混勻后，加1ml萃取液，渦旋混合5min，13000r/min離心10min，取上清800μl；氮氣吹干，以10％甲醇水100μl進行復溶，渦旋3min；13000r/min，離心3min，進樣檢測。

優選地，所述內標溶液配制：準確稱取孕酮、睪酮標準品，分別用甲醇溶解后配制1mg/ml的儲備液；孕酮標準溶液儲備液10μl與睪酮標準溶液儲備液10μl混合，再以純甲醇稀釋至400μl，得25μg/ml的工作液。

優選地，所述萃取液為乙酸乙酯。

優選地，所述氮氣吹干溫度為40～50℃。

本發明的另一方面通過以下方案實現：

高效液相色譜串聯質譜技術檢測唾液中孕酮和睪酮的試劑盒，所述試劑盒包括如下試劑：

(1)洗脫液：

洗脫液A：0.05％V/V的甲酸水；

洗脫液B：甲醇，色譜純；

(2)標準品母液：孕酮的甲醇溶液，睪酮的甲醇溶液；

配制：分別精確稱取10mg孕酮、睪酮標準品，分別用甲醇溶解定容至 10ml，得1mg/ml的母液；

(3)內標液：d9-孕酮的甲醇溶液；

配制：精確稱取10mg d9-孕酮的標準品，用甲醇溶解定容至10ml，得 1mg/ml的母液；用甲醇依次稀釋得50ng/ml的內標溶液；

(4)稀釋液：

稀釋液1：空白唾液基質溶液，將0.4g牛血清蛋白用水定容至10ml制得；

稀釋液2：甲醇；

(5)萃取液：乙酸乙酯；

(6)質控品：孕酮和睪酮的空白唾液基質溶液，分低中高濃度QC(L)、 QC(M)、QC(H)，濃度分別為：50pg/ml、100pg/ml、250pg/ml；

孕酮標準溶液儲備液10μl與睪酮標準溶液儲備液10μl混合，再以純甲醇稀釋至400μl，得25μg/ml的溶液A，取100μl溶液A甲醇稀釋至100ml 得25ng/ml的溶液B；

QC(H)：取100μl溶液B，用稀釋液1定容至10ml；

QC(M)：取40μl溶液B，用稀釋液1定容至10ml；