[發明專利]一種外源基因DNA片段克隆到質粒載體相鄰或重疊的限制性內切酶酶切位點的方法

有效

• 申請號: 201610219972.9
• 申請日: 2016-04-07
• 公開（公告）號: CN105779481B
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 廖東慶;黃日波;李曉明;韋航;韋旭欽;王青艷
• 申請（專利權）人: 南寧中諾生物工程有限責任公司
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 王素娥

本發明公開了一種外源基因DNA片段克隆到質粒載體相鄰或重疊的限制性內切酶酶切位點的方法。質粒載體用限制性內切酶A\B、A\C分別酶切，得到AB、BA及AC、CA四個DNA片段。(B、C為質粒載體上相鄰或重疊的限制性內切酶酶切位點)。外源基因DNA片段用限制性內切酶B、C酶切，得到BC片段。AB、BC、CA與AC、BC、BA這三個DNA片段分別進行連接、轉化，涂布在篩選平板上培養，再挑取單菌落進行篩選，可以得到外源基因連入質粒載體正反兩個方向的重組質粒。本發明的優點是：使用本發明構建的質粒載體，無法進行雙酶切的相鄰或重疊的限制性內切酶酶切位點也可作為克隆外源基因DNA片段的選擇；另外，外源基因DNA片段連入載體的兩個方向也可實現。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種質粒載體的構建方法，具體是一種外源基因DNA片段克隆到質粒載體相鄰或重疊的限制性內切酶酶切位點的方法

背景技術

當前外源基因DNA片段克隆到質粒載體的常規方法為質粒載體和外源基因DNA片段分別用能切開相匹配末端的限制性內切酶進行酶切，然后兩者混合，用DNA連接酶進行連接，轉化，再從篩選平板中挑單菌落進行篩選驗證。但無法進行雙酶切的相鄰或重疊的限制性內切酶酶切位點不能作為克隆外源基因DNA片段的選擇。另外，質粒載體上酶切位點的順序決定了外源基因DNA片段克隆到載體的方向，同樣制約了使用。

發明內容

本發明的目的是提供一種外源DNA片段克隆到質粒載體相鄰或重疊的限制性內切酶酶切位點的方法。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

一種外源基因DNA片段克隆到質粒載體相鄰或重疊的限制性內切酶酶切位點的方法，該方法的步驟為：將質粒載體分別用限制性內切酶A\B及A\C進行雙酶切，膠回收后獲得AB、BA及AC、CA四個DNA片段。外源基因DNA片段用限制性內切酶B、C分步或雙酶切，得到BC片段。AB、BC、CA與AC、BC、BA這三個DNA片段分別進行連接、轉化，涂布在篩選平板上培養，再挑取單菌落進行篩選，可以得到外源基因連入質粒載體正反兩個方向的重組質粒。

上述質粒載體上的限制性內切酶B、C為相鄰或重疊的酶切位點。

本發明的優點是：使用本發明構建的質粒載體，無法進行雙酶切的相鄰或重疊的限制性內切酶酶切位點也可作為克隆外源基因DNA片段的選擇；另外，外源基因DNA片段連入載體的兩個方向也可實現。

附圖說明

圖1是本發明的構建流程圖。

具體實施方式

下面結合具體的實施例，進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。

實施例1

外源基因DNA片段正向連接到質粒載體pUC19相鄰酶切位點BamHⅠ、XbaⅠ質粒載體pUC19用ScaⅠ\BamHⅠ雙酶切后可形成約1.7kb、0.9kb大小兩片段，分別膠回收，小片段命名為ScaⅠ-BamHⅠ，大片段命名為BamHⅠ-ScaⅠ(大片段BamHⅠ-ScaⅠ在實施例2中備用)；pUC19用ScaⅠ\XbaⅠ雙酶切后可形成約1.7kb、0.9kb大小兩片段，分別膠回收，小片段命名為ScaⅠ-XbaⅠ(小片段ScaⅠ-XbaⅠ在實施例2中備用)，大片段命名為XbaⅠ-ScaⅠ。