[發明專利]一種核苷磷酸化酶、編碼基因及其高產菌株和應用

有效

• 申請號: 201610218675.2
• 申請日: 2016-04-26
• 公開（公告）號: CN105670979B
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發明（設計）人: 何冰芳;劉柯;周有治;張勁松;儲建林
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/10;C12N15/54;C12P19/38;C12R1/01
• 代理公司: 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙) 32238
• 代理人: 袁靜

本發明提供一種核苷磷酸化酶、編碼基因及其高產菌株和應用，涉及生物制藥技術領域。核苷磷酸化酶高產菌株，其分類命名為波茨坦短芽孢桿菌(Brevibacillus borstelensis)LK01，保藏編號為CCTCC NO:M 2015685。本發明還提供由所述菌株產生的核苷磷酸化酶及其編碼基因。本發明還提供含有所述基因的重組表達載體或重組菌及其應用。采用本發明核苷磷酸化酶制備核苷類藥物，反應條件溫和，產物成分單一，無副產物，底物轉化率較高，產物易于純化，成功克服了目前化學法糖基化修飾核苷類藥物存在的問題，具有很好的應用潛力。

技術領域

本發明涉及生物制藥技術領域，具體涉及一種核苷磷酸化酶、編碼基因及其高產菌株和應用。

背景技術

天然核苷是由核糖或脫氧核糖與天然堿基所形成，由于天然堿基的多樣性，構成的核糖核苷或脫氧核糖核苷也是種類繁多。天然核苷中的堿基或糖基經過化學修飾形成新的核苷，這種經過人工合成的核苷即為核苷類似物。核苷類似物與核苷酸在化學結構上具有類似性，可以假亂真混入DNA合成的過程中，但因其不具備核苷酸的功能，所以導致合成的核酸鏈失去了正常的功能。通過氮雜、脫氮、取代等化學修飾方法，對正常堿基的嘧啶和嘌呤進行修飾就可得到核苷類藥物。核苷類似物在病毒或腫瘤細胞的遺傳物質表達的過程中，被整合到DNA鏈中，不僅大大降低了聚合酶的活性，也終止了DNA的合成，從而使病毒細胞無法增殖傳代，導致病毒的滅亡。因此，核苷類藥物在治療艾滋病毒、乙肝病毒、腫瘤等領域表現出極大的優勢。據統計，在目前使用的抗病毒藥物中有將近50％是核苷類藥物。

核苷類藥物中的5-氟尿苷是一種重要的5-氟嘧啶類衍生物，可以制備多種抗癌抗病毒藥物，特別是可以做為抗腫瘤新藥氟鐵龍(DFUR)的前體。氟鐵龍(2'-deoxy-5-fluorouridine)為脲嘧啶類抗代謝物,屬細胞周期特異性抗腫瘤藥,可抑制胸腺嘧啶脫氧核苷酸合成酶,阻斷脲嘧啶脫氧核苷酸轉變成胸腺嘧啶核苷酸,從而影響DNA的合成,起到抗病毒和抗腫瘤的作用。該藥對多種腫瘤細胞具有顯著的抑制作用,臨床上主要用于治療肝癌、胃腸系癌、乳腺癌和頭頸部腫瘤等,與常用抗腫瘤藥物5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)相比,具有低細胞毒性和易于在體內被吸收的優點。

現有技術中，常采用化學法糖基化得到脫氧氟尿苷，產物中會出現多種同分異構體，并且合成步驟繁多，需要對堿基或核糖基上的活性基團進行修飾保護，且合成過程中大量使用有機溶劑，同時還要使用毒性較大的氟化物、溴化物、重金屬等，對環境造成巨大的污染。核苷磷酸化酶可以催化核苷或脫氧核苷的糖苷鍵的可逆磷酸化反應，提供核糖-1-磷酸，并釋放堿基，加入其它堿基可形成另一種新的核苷。因此，核苷磷酸化酶主要用作酶法合成核苷類似物的工具。但是，現有核苷磷酸化酶的轉化率較低，制備核苷類藥物的成本較高。

發明內容

本發明的目的是提供一種核苷磷酸化酶高產菌株，產生的核苷磷酸化酶能夠高效制備核苷類似物。

本發明的另一目的是提供核苷磷酸化酶及其編碼基因，該酶能夠用于高效制備核苷類似物。

為了實現本發明的目的，本發明首先從本實驗室耐有機溶劑菌庫中篩選獲得一株核苷磷酸化酶產生菌，分類命名為波茨坦短芽孢桿菌(Brevibacillus borstelensis)LK01，其保藏編號為CCTCC NO:M 2015685。

本發明對波茨坦短芽孢桿菌(Brevibacillus borstelensis)LK01的生物學特性進行鑒定，該菌株為革蘭氏陽性菌，菌體的形態特征為桿狀，細胞大小為(0.3～0.4μm)*(2～7μm)，有明顯的凹陷，周生鞭毛，中生芽孢，運動。菌落呈圓形，顏色為乳白色，表面光滑，不透明，不凹起。氧化酶反應呈陰性，明膠反應呈陽性。淀粉水解實驗呈陰性，硝酸鹽反應呈陽性，VP反應呈陰性，葡萄糖反應呈陽性，檸檬酸反應呈陽性，阿拉伯糖反應呈陰性，木糖反應呈陰性。