[發(fā)明專利]鑒定番茄頸腐根腐病抗性的高通量分子標(biāo)記及其標(biāo)記方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610218232.3
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN105671190A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 國家進(jìn);張生;程琳;陳福東;張曉燕;董甜;李曉杰;劉岳;王如芳;董靜;于彩玉
• 申請（專利權(quán)）人: 山東壽光蔬菜種業(yè)集團(tuán)有限公司;山東省壽光蔬菜產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 濰坊正信專利事務(wù)所 37216
• 代理人: 石譽(yù)虎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒定番茄頸腐根腐病抗性的高通量分子 標(biāo)記及其標(biāo)記方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

番茄頸腐根腐病(Fusariumcrownandrootrot,FCRR)是由尖孢鐮刀菌番茄頸 腐根腐病專化型(Fusariumoxysporumf.sp.radicis-lycopersici)侵染引起的土傳病 害，主要癥狀表現(xiàn)為在土壤與番茄植株莖基部交接處，環(huán)繞莖基部有明顯的深褐色病斑。3- 5片葉的幼苗被侵染從發(fā)病部位折倒而萎蔫死亡；5葉期以后至開花結(jié)果期植株發(fā)病，則表 現(xiàn)為莖基部縊縮、呈深褐色，葉片逐漸萎蔫致死(耿麗華等，2012)。該病害最早發(fā)現(xiàn)于日本 和美國的加利福尼亞，之后在很多國家爆發(fā)并成為嚴(yán)重影響番茄保護(hù)地生產(chǎn)和露地生產(chǎn)的 重要病害(SatoandAraki,1974；ScottandJones,2000；Scott,2008)。在國內(nèi)，江蘇、山 東、遼寧、寧夏等地多年連作的塑料大棚和日光溫室中均有番茄頸腐根腐病發(fā)生的報(bào)道，并 呈現(xiàn)逐年加重，迅速蔓延的趨勢。我省大棚和日光溫室番茄主產(chǎn)區(qū)包括煙臺海陽市、濰坊壽 光市、東營廣饒縣、德州齊河縣與臨邑縣、臨沂費(fèi)縣與蒼山縣等番茄頸腐根腐病已普遍發(fā) 生，其中壽光蔬菜老菜棚80％以上發(fā)病，致死率在30％以上，高的達(dá)100％，造成嚴(yán)重減產(chǎn)甚 至絕產(chǎn)。番茄頸腐根腐病已成為我國繼線蟲、黃化曲葉病毒等毀滅性病害爆發(fā)之后的另一 重要普遍性病害，嚴(yán)重威脅著我省一百多萬畝的保護(hù)地番茄生產(chǎn)，涉及千家萬戶菜農(nóng)的收 成。

Fazio等(1999)開發(fā)了抗番茄頸腐根腐病的RAPD分子標(biāo)記，它們以TG101-UBC 655-UBC116-UBC194-Frl的順序連鎖，其中UBC194與Frl緊密連鎖，可以用于分子標(biāo)記輔 助育種。然而，Tanyolac(2010)和Truong(2011)的研究結(jié)果則否認(rèn)了UBC194標(biāo)記標(biāo)定Frl 基因的有效性，并且認(rèn)為RAPD技術(shù)不能區(qū)分雜合和純合材料，具有很大局限性。2014年報(bào)道 的Frl基因的CAPS標(biāo)記C2-25是根據(jù)與Frl緊密連鎖的保守序列位點(diǎn)C2-At2g38025設(shè)計(jì)，此 序列位于番茄9號染色體45cM的位置上(Staniaszeketal.,2014)。但是，CAPS標(biāo)記需要酶 切，成本高，實(shí)驗(yàn)程序繁瑣，無法實(shí)現(xiàn)高通量檢測。最近，NedimMutlu等(2015)在保守序列位 點(diǎn)C2-At4g28660開發(fā)了Frl的SCAR分子標(biāo)記，但其僅處于基礎(chǔ)研究階段，應(yīng)用于田間輔助育 種的準(zhǔn)確性和實(shí)用性未得到有效驗(yàn)證。

綜上所述，到目前為止，番茄育種中缺乏能有效跟蹤Frl基因的分子標(biāo)記，制約了 番茄抗頸腐根腐病品種的育種效率和育種進(jìn)程。開發(fā)有效的、易于操作且田間實(shí)用性強(qiáng)的 Frl基因高通量分子標(biāo)記，對培育抗頸腐根腐病的番茄優(yōu)良品種，有效控制番茄頸腐根腐病 的危害，具有重要意義，也是一項(xiàng)重要的育種方法創(chuàng)新和技術(shù)創(chuàng)新。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中需要酶切，成本高，實(shí)驗(yàn)程序繁瑣，檢測效率低等不 足與缺陷，提供一種成本低、快捷高效、準(zhǔn)確率高的抗番茄頸腐根腐病高通量分子標(biāo)記及其 標(biāo)記方法和應(yīng)用。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供的用于檢測抗性基因Frl的高通量分子標(biāo)記包括引物Frl_Allele-F1、 引物Frl_Allele-F2和引物Frl-R；引物為包含以下序列的引物，序列如下：

Frl-Allele-F1：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATT-3’；

(下劃線部分為FAM熒光標(biāo)簽序列)

Frl-Allele-F2：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATA-3’；

(下劃線部分為HEX熒光標(biāo)簽序列)

Frl-R：

5’-ATTTCTTACCATATGTGAAGAGAA-3’

更加具體的，設(shè)計(jì)引物Frl-F1、引物Frl-F2和引物Frl-R，并在上述引物Frl-F1和 Frl-F2的在5’端分別加上相應(yīng)的熒光標(biāo)簽序列。