[發明專利]鑒定番茄頸腐根腐病抗性的高通量分子標記及其標記方法與應用

在審

• 申請號: 201610218232.3
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN105671190A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 國家進;張生;程琳;陳福東;張曉燕;董甜;李曉杰;劉岳;王如芳;董靜;于彩玉
• 申請（專利權）人: 山東壽光蔬菜種業集團有限公司;山東省壽光蔬菜產業集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 濰坊正信專利事務所 37216
• 代理人: 石譽虎

1.鑒定番茄頸腐根腐病抗性的高通量分子標記，其特征在于：所述分子標記是通過設 計引物Frl-F1、引物Frl-F2和引物Frl-R；所述引物Frl-F1和所述引物Frl-F2在5’端加上相 應的熒光標簽序列后，與所述引物Frl-R一起實現的；所述引物Frl-F1、引物Frl-F2和引物 Frl-R為包含以下序列的引物：

Frl-F1：5’-TAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATT-3’；

Frl-F2：5’-TAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATA-3’；

Frl-R：5’-ATTTCTTACCATATGTGAAGAGAA-3’。

2.如權利要求1所述的鑒定番茄頸腐根腐病抗性的高通量分子標記，其特征在于：所述 熒光標簽序列為：

Frl-F1adaptor：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，FAM熒光標簽序列；

Frl-F2adaptor：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，HEX熒光標簽序列。

3.如權利要求2所述的鑒定番茄頸腐根腐病抗性的高通量分子標記，其特征在于：所述 分子標記所用的引物為：

Frl-Allele-F1：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATT-3’；

Frl-Allele-F2：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATA-3’；

Frl-R：

5’-ATTTCTTACCATATGTGAAGAGAA-3’。

4.鑒定番茄頸腐根腐病抗性的高通量分子標記方法，其特征在于：

a使用CTAB法提取番茄全基因組DNA；

b利用權利要求3所述的引物Frl-Allele-F1、引物Frl-Allele-F2、引物Frl-R以番茄全 基因組DNA為模板進行PCR擴增；

c對PCR擴增產物進行熒光掃描；

d分析等位基因分型結果。

5.如權利要求4所述的鑒定番茄頸腐根腐病抗性的高通量分子標記方法，其特征在于： 所述步驟b中PCR反應體系為KASP基因分型PCR反應體系:5ngDNA，0.07ulKASP72×assay mix，2.5ulKASPV4.02×MasterMix，加ddH₂O至5ul；擴增反應程序為：階段1：94℃預變性 15min；階段2：94℃20s，62-56℃1min，其中每個循環下降0.6℃，共10個循環；階段3：94℃ 20s，56℃1min，共26個循環。

6.如權利要求5所述的鑒定番茄頸腐根腐病抗性的高通量分子標記方法，其特征在于： 所述KASP基因分型PCR反應體系中KASP72Хassaymix由權利要求3所述的引物Frl- Allele-F1、引物Frl-Allele-F2和引物Frl-R分別稀釋至濃度為100uM后，與ddH₂O按12︰12︰ 30︰46的體積比混合得到。

7.如權利要求5所述的鑒定番茄頸腐根腐病抗性的高通量分子標記方法，其特征在于： 所述KASP基因分型PCR反應體系中KASPV4.02ХMasterMix中包含有熒光探針A、熒光探針 B、淬滅探針A、淬滅探針B、高保真酶和dNTP。

8.如權利要求7所述的鑒定番茄頸腐根腐病抗性的高通量分子標記方法，其特征在于： 所述熒光探針A的序列為5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，5’末端連接1個FAM熒光基團；所 述熒光探針B的序列為5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端連接1個HEX熒光基團；所述 淬滅探針A的序列為5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，3’末端連接淬滅基團BHQ；所述淬滅探 針B的序列為5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，3’末端連接淬滅基團BHQ。