[發(fā)明專利]鑒定番茄葉霉病抗性的高通量分子標(biāo)記及其標(biāo)記方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610217298.0
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN105624328B
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程琳;張生;國家進(jìn);陳福東;張曉燕;董甜;李曉杰;劉岳;王如芳;董靜;于彩玉
• 申請（專利權(quán)）人: 山東壽光蔬菜種業(yè)集團(tuán)有限公司;山東省壽光蔬菜產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 濰坊正信致遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37255
• 代理人: 石譽(yù)虎

1.鑒定番茄葉霉病抗性的方法，其特征在于：所述方法是通過利用分子標(biāo)記的引物對番茄全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和鑒定實(shí)現(xiàn)的；

所述分子標(biāo)記的引物為：

Cf-5-Allele-F1：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTGAAATCATGTTTCCTGATCTT-3’；

Cf-5-Allele-F2：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTGAAATCATGTTTCCTGATCTC-3’；

Cf-5-R：5’-CTTAGATTTCCAGTCGAGATCAAG-3’；

所述方法包括以下步驟：

a使用CTAB法提取番茄全基因組DNA；

b利用所述的引物Cf-5-Allele-F1、引物Cf-5-Allele-F2和引物Cf-5-R以番茄全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述PCR擴(kuò)增的體系為KASP基因分型PCR反應(yīng)體系，所述KASP基因分型PCR反應(yīng)體系為：5ngDNA，0.07μl KASP 72×assay mix，2.5μl KASP V4.02×MasterMix，將上述三種物質(zhì)混合，加ddH₂O至5μl；

其中，KASP72×assay mix由濃度為100μM的引物Cf-5-Allele-F1、引物Cf-5-Allele-F2和引物Cf-5-R與ddH₂O按12︰12︰30︰46的體積比混合得到；

KASP V4.02×Master Mix由熒光探針A、熒光探針B、淬滅探針A和淬滅探針B，高保真酶和dNTP組成；其中，熒光探針A為：在5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’的5’末端連接1個(gè)FAM熒光基團(tuán)；熒光探針B為：在5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’的5’末端連接1個(gè)HEX熒光基團(tuán)；淬滅探針A為：在5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’的3’末端連接淬滅基團(tuán)BHQ；淬滅探針B為：在5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’的3’末端連接淬滅基團(tuán)BHQ；

c對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光掃描；

d分析等位基因分型結(jié)果。

2.如權(quán)利要求1所述的鑒定番茄葉霉病抗性的方法，其特征在于：所述步驟b中擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋弘A段1：94℃預(yù)變性15min；階段2：94℃20s，65-55℃1min，其中每個(gè)循環(huán)下降1.0℃，共10個(gè)循環(huán)；階段3：94℃20s，55℃1min，共26個(gè)循環(huán)。

3.如權(quán)利要求1所述的鑒定番茄葉霉病抗性的方法，其特征在于：所述步驟c中熒光掃描是采用Kraken軟件對掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果確定番茄Cf-5的基因型，若待測番茄擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號數(shù)據(jù)經(jīng)Kraken軟件分析在所得分型聚類圖中呈現(xiàn)藍(lán)色，則所述待測番茄Cf-5基因型為T︰T，即為番茄葉霉病抗病植株；若呈現(xiàn)紅色，則基因型為C︰C，即為感病植株；若呈現(xiàn)綠色，則基因型為T︰C，即為雜合抗病植株。