[發(fā)明專利]一種草酸脫羧酶及草酸脫羧酶的重組表達(dá)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610217032.6
• 申請(qǐng)日: 2016-04-08
• 公開（公告）號(hào): CN105695441A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉海峰;吳玉峰;宋保平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢康復(fù)得生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/88
• 分類號(hào): C12N9/88;A23L33/10;A61K38/51;A61P13/04;A61P13/00;C12N15/70
• 代理公司: 北京匯澤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11228
• 代理人: 程殿軍;張瑾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新的低pH環(huán)境下穩(wěn)定且高效的草酸脫羧酶，以及草酸脫 羧酶的重組表達(dá)方法。

背景技術(shù)

草酸(oxalicacid)是一種分子式為C₂O₄H₂、分子量為90.04的二元有機(jī)酸， 存在于常見的絕大多數(shù)食物中，在特定食物(如菠菜或其它綠色蔬菜、綠茶、 可可豆，豆?jié){，咖啡等)中含量很高。草酸在生物體內(nèi)為最終產(chǎn)物，不能被進(jìn) 一步分解，主要排泄方式是隨尿液一起排出。人體中的草酸包括外源性草酸和 內(nèi)源性草酸，外源性草酸是指通過(guò)飲食攝入的草酸，內(nèi)源性草酸是指人體肝臟 自身代謝產(chǎn)生的草酸，正常人體內(nèi)的外源性草酸和內(nèi)源性草酸的含量基本相同。 某些腎結(jié)石高發(fā)人群則外源性草酸遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于內(nèi)源性草酸。

人體內(nèi)血液和尿液中的草酸含量過(guò)高時(shí)，容易與鈣離子形成不溶性的草酸 鈣晶體，草酸鈣晶體很容易在膀胱、腎臟等器官內(nèi)沉積形成結(jié)石。II型高草酸 尿癥是指食源性草酸吸收異常，導(dǎo)致尿草酸較正常人偏高，是原發(fā)性高草酸尿 癥外導(dǎo)致結(jié)石的重要因素，因此，控制從飲食中攝取的草酸，很大程度上就可 以降低尿草酸量，從而降低患結(jié)石風(fēng)險(xiǎn)。低草酸飲食或降解食物中草酸的防治 草酸鈣結(jié)石的策略在醫(yī)學(xué)界已成為共識(shí)。飲食中草酸主要在胃中被釋放出來(lái)， 濃度也相對(duì)較高，非常有利于酶法降解去除，但是胃中的低pH環(huán)境及胃蛋白 酶對(duì)草酸降解酶的活力有很大的挑戰(zhàn)，因此尋找在低pH條件下能高效降解草 酸的酶成為此治療技術(shù)的關(guān)鍵。

目前已發(fā)現(xiàn)的具有分解草酸功能的酶，有草酸脫羧酶(以下簡(jiǎn)稱“OXDC”)、 草酸氧化酶和草酰CoA脫羧酶。OXDC的作用是催化草酸分解為甲酸和二氧 化碳。迄今已知，已有報(bào)道的OXDC主要來(lái)自芽孢桿菌(Bacillus)屬、曲霉 (Aspergillus)屬、金針菇(Flammulinavelutipes)，云芝(Coriolusversicolor)， 白腐菌(Trametesversicolor)等。草酸脫羧酶在上述物種中的表達(dá)量極低，而 且多數(shù)菌種生長(zhǎng)緩慢，成分復(fù)雜，分離提取純化十分困難，不具備商業(yè)化應(yīng)用 可能，所以將草酸脫羧酶進(jìn)行重組表達(dá)生產(chǎn)成為其商業(yè)化應(yīng)用的必然選擇。目 前草酸脫羧酶中實(shí)現(xiàn)原核重組表達(dá)的是枯草芽孢桿菌屬的YvrK基因來(lái)源 OXDC，并對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的解析，但是其酶活力范圍為pH3.0～6.0，低于3.0 無(wú)活力。金針菇來(lái)源的OXDC有通過(guò)煙草表達(dá)成功過(guò)報(bào)道，但表達(dá)量極低，同 時(shí)也進(jìn)行了原核(E.coli)表達(dá)但無(wú)酶活力(參見文獻(xiàn)：MeenuKesarwani，et.al OxalateDecarboxylasefromCollybiavelutipes，THEJOURNALOF BIOLOGICALCHEMISTRY，2000)，其他種屬或基因來(lái)源OXDC，尤其是真核 生物的OXDC，尚未發(fā)現(xiàn)有成功進(jìn)行重組表達(dá)的報(bào)道，尤其是用大腸桿菌系統(tǒng) 進(jìn)行重組表達(dá)的。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中低pH(pH＜3.0)穩(wěn)定且有活力的OXDC無(wú)法進(jìn)行大 腸桿菌重組表達(dá)這一技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)高通量篩選，獲得了多個(gè)在胃腸道 環(huán)境下(pH1.5～7.5)均有較高草酸降解酶活力，且在低pH胃環(huán)境(pH1.5～3.0) 有高活力的草酸脫羧酶，并克隆得到其編碼基因通過(guò)改造實(shí)現(xiàn)了其重組表達(dá)。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了低pH穩(wěn)定且有活力的OXDC的大腸桿菌重組表 達(dá)方法。

本發(fā)明提供的一種草酸脫羧酶，其為通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)， 并在pH＜3.0時(shí)穩(wěn)定且有活力；表達(dá)過(guò)程中該草酸脫羧酶的蛋白序列較原生酶 蛋白序列缺失信號(hào)肽片段。重組表達(dá)時(shí)，將這些草酸脫羧酶信號(hào)肽部分的DNA 序列去除，使得改造后的基因不含信號(hào)肽編碼序列，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌重組表達(dá)， 克服了現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于pH＜3.0時(shí)穩(wěn)定且有活力的草酸脫羧酶無(wú)法通過(guò)大腸桿 菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的問(wèn)題，降低了生產(chǎn)成本。

所述的pH＜3.0時(shí)穩(wěn)定且有活力，是指在pH低于3.0的環(huán)境下仍然有活力， 并且酶功能穩(wěn)定。該草酸脫羧酶，優(yōu)選在pH＜2.8，pH＜2.6，pH＜2.4，pH＜ 2.2，pH＜2.0，pH<1.8或pH<1.5環(huán)境下穩(wěn)定且有活力。