[發明專利]一種草酸脫羧酶及草酸脫羧酶的重組表達方法

在審

• 申請號: 201610217032.6
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN105695441A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 劉海峰;吳玉峰;宋保平
• 申請（專利權）人: 武漢康復得生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;A23L33/10;A61K38/51;A61P13/04;A61P13/00;C12N15/70
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 程殿軍;張瑾

技術領域

本發明涉及一種新的低pH環境下穩定且高效的草酸脫羧酶，以及草酸脫 羧酶的重組表達方法。

背景技術

草酸(oxalicacid)是一種分子式為C₂O₄H₂、分子量為90.04的二元有機酸， 存在于常見的絕大多數食物中，在特定食物(如菠菜或其它綠色蔬菜、綠茶、 可可豆，豆漿，咖啡等)中含量很高。草酸在生物體內為最終產物，不能被進 一步分解，主要排泄方式是隨尿液一起排出。人體中的草酸包括外源性草酸和 內源性草酸，外源性草酸是指通過飲食攝入的草酸，內源性草酸是指人體肝臟 自身代謝產生的草酸，正常人體內的外源性草酸和內源性草酸的含量基本相同。 某些腎結石高發人群則外源性草酸遠遠大于內源性草酸。

人體內血液和尿液中的草酸含量過高時，容易與鈣離子形成不溶性的草酸 鈣晶體，草酸鈣晶體很容易在膀胱、腎臟等器官內沉積形成結石。II型高草酸 尿癥是指食源性草酸吸收異常，導致尿草酸較正常人偏高，是原發性高草酸尿 癥外導致結石的重要因素，因此，控制從飲食中攝取的草酸，很大程度上就可 以降低尿草酸量，從而降低患結石風險。低草酸飲食或降解食物中草酸的防治 草酸鈣結石的策略在醫學界已成為共識。飲食中草酸主要在胃中被釋放出來， 濃度也相對較高，非常有利于酶法降解去除，但是胃中的低pH環境及胃蛋白 酶對草酸降解酶的活力有很大的挑戰，因此尋找在低pH條件下能高效降解草 酸的酶成為此治療技術的關鍵。

目前已發現的具有分解草酸功能的酶，有草酸脫羧酶(以下簡稱“OXDC”)、 草酸氧化酶和草酰CoA脫羧酶。OXDC的作用是催化草酸分解為甲酸和二氧 化碳。迄今已知，已有報道的OXDC主要來自芽孢桿菌(Bacillus)屬、曲霉 (Aspergillus)屬、金針菇(Flammulinavelutipes)，云芝(Coriolusversicolor)， 白腐菌(Trametesversicolor)等。草酸脫羧酶在上述物種中的表達量極低，而 且多數菌種生長緩慢，成分復雜，分離提取純化十分困難，不具備商業化應用 可能，所以將草酸脫羧酶進行重組表達生產成為其商業化應用的必然選擇。目 前草酸脫羧酶中實現原核重組表達的是枯草芽孢桿菌屬的YvrK基因來源 OXDC，并對其進行酶學性質的解析，但是其酶活力范圍為pH3.0～6.0，低于3.0 無活力。金針菇來源的OXDC有通過煙草表達成功過報道，但表達量極低，同 時也進行了原核(E.coli)表達但無酶活力(參見文獻：MeenuKesarwani，et.al OxalateDecarboxylasefromCollybiavelutipes，THEJOURNALOF BIOLOGICALCHEMISTRY，2000)，其他種屬或基因來源OXDC，尤其是真核 生物的OXDC，尚未發現有成功進行重組表達的報道，尤其是用大腸桿菌系統 進行重組表達的。

發明內容

為了解決現有技術中低pH(pH＜3.0)穩定且有活力的OXDC無法進行大 腸桿菌重組表達這一技術問題，本發明通過高通量篩選，獲得了多個在胃腸道 環境下(pH1.5～7.5)均有較高草酸降解酶活力，且在低pH胃環境(pH1.5～3.0) 有高活力的草酸脫羧酶，并克隆得到其編碼基因通過改造實現了其重組表達。 本發明的另一個目的是提供了低pH穩定且有活力的OXDC的大腸桿菌重組表 達方法。

本發明提供的一種草酸脫羧酶，其為通過大腸桿菌表達系統進行重組表達， 并在pH＜3.0時穩定且有活力；表達過程中該草酸脫羧酶的蛋白序列較原生酶 蛋白序列缺失信號肽片段。重組表達時，將這些草酸脫羧酶信號肽部分的DNA 序列去除，使得改造后的基因不含信號肽編碼序列，實現了大腸桿菌重組表達， 克服了現有技術中對于pH＜3.0時穩定且有活力的草酸脫羧酶無法通過大腸桿 菌表達系統生產的問題，降低了生產成本。

所述的pH＜3.0時穩定且有活力，是指在pH低于3.0的環境下仍然有活力， 并且酶功能穩定。該草酸脫羧酶，優選在pH＜2.8，pH＜2.6，pH＜2.4，pH＜ 2.2，pH＜2.0，pH<1.8或pH<1.5環境下穩定且有活力。