[發(fā)明專(zhuān)利]一種高靈敏檢測(cè)黃曲霉毒素的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610216721.5
• 申請(qǐng)日: 2016-04-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105651899B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 焦揚(yáng);楊亞玲;趙嬌
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 云南健牛生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/02
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N21/64
• 代理公司: 昆明今威專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)食品中黃曲霉毒素的新方法，主要將現(xiàn)行黃曲霉毒素的柱前衍生技術(shù)與柱后衍生技術(shù)結(jié)合，柱前衍生反應(yīng)在紫外光線照射下進(jìn)行，使衍生反應(yīng)進(jìn)行的完全且產(chǎn)生的熒光強(qiáng)，衍生產(chǎn)物熒光穩(wěn)定性好，同時(shí)又提高了檢測(cè)靈敏度。與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中黃曲霉毒素測(cè)定方法相比，該法具有檢測(cè)靈敏度高，不需要柱后光衍生設(shè)備，重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高靈敏檢測(cè)黃曲霉毒素的方法及其應(yīng)用。屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

黃曲霉毒素(aflatoxin,AFT)是一類(lèi)由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類(lèi)含有二氫呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)次級(jí)代謝物，是迄今發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的一類(lèi)真菌毒素，目前已發(fā)現(xiàn)的有20多種，在食品中較常見(jiàn)的包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1等，它們毒性大小的排列順序?yàn)锳FTB1＞AFTM1＞AFTG1＞AFTB2＞AFTG2。黃曲霉毒素對(duì)動(dòng)物及人體的危害主要是肝臟損害，可引發(fā)肝炎、肝硬化、肝部壞死、肝癌等疾病，是誘發(fā)惡性腫瘤原發(fā)性肝細(xì)胞癌的主要因素之一。黃曲霉毒素常存在于玉米、谷物、花生及其他堅(jiān)果中。

黃曲霉毒素檢測(cè)過(guò)程中，由于B1和G1的熒光檢測(cè)靈敏度低，通常需要衍生增強(qiáng)熒光，以提高檢測(cè)器對(duì)目的物的響應(yīng)。目前衍生的方法主要有柱前三氟乙酸衍生法和柱后碘衍生法及光化學(xué)衍生法。光化學(xué)柱后衍生是目前檢測(cè)黃曲霉毒素的最常用方法，柱后光化學(xué)衍生反應(yīng)原理是利用環(huán)狀化合物在紫外光照射下能產(chǎn)生熒光這一特性，通過(guò)紫外光使流動(dòng)相中光解出光子，與AFB1和AFG1分子上的活性雙鍵發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生了熒光特性更強(qiáng)且更穩(wěn)定的物質(zhì)，解決了AFB1和AFG1在水溶液中的熒光淬滅現(xiàn)象。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18979-2003食品中黃曲霉毒素測(cè)定，采用高效液相色譜儀柱后碘溶液衍生測(cè)定黃曲霉毒素的含量，總量檢出限為1μg/kg；國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.23-2006食品中黃曲霉毒素測(cè)定，采用高效液相色譜儀柱前衍生測(cè)定黃曲霉毒素的含量，AFB1和AFG1檢出限為0.2μg/kg。

目前的HPLC測(cè)定黃曲霉毒素或者是用柱前衍生或者是柱后衍生結(jié)合熒光測(cè)定。但也存在柱前衍生后熒光不穩(wěn)定及附加柱后衍生設(shè)備的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短的黃曲霉毒素的測(cè)定方法。

一種高靈敏檢測(cè)黃曲霉毒素的方法及其應(yīng)用，包括以下步驟：

(1)工作曲線的制作：分別配制黃曲霉毒素B10.5～200ng/mL、黃曲霉毒素G10.5～100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入一定量的衍生試劑，在紫外燈下照射一定時(shí)間進(jìn)行衍生反應(yīng)，在選定色譜條件下進(jìn)高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定，得到黃曲霉毒素回歸方程、相關(guān)系數(shù)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、回收率。

(2)樣品提取：

①對(duì)于大米、玉米、小麥、花生、核桃、杏仁及其制品及中藥提取方法為：準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎均質(zhì)后的樣品2～5g，精確至0.0001g，加入體積分?jǐn)?shù)為70～80％的乙腈水溶液20～50mL，劇烈振蕩1min，50±2℃水浴超聲提取20～30min，以3500～5000r/min離心5～10min，取出上層溶液，重復(fù)提取2～3次，合并上清液，待用；或者

②對(duì)于醬油、食醋、植物油脂提取方法為：準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00～10.00g樣品，加入2～5gNaCl和體積分?jǐn)?shù)為70～80％的乙腈水溶液20～50mL，渦旋混合1～3min，定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確吸取5.00mL濾液，加入10mL超純水稀釋?zhuān)靹颍谩?/p>

(3)樣品測(cè)定

取步驟(2)中的提取液，按照步驟(1)進(jìn)行熒光衍生，在與步驟(1)相同色譜條件進(jìn)行HPLC分析，并對(duì)照步驟(1)所得的線性回歸方程，計(jì)算樣品中黃曲霉毒素的含量。

所述的食品樣品中待測(cè)黃曲霉毒素包括：黃曲霉毒素B1、G1。