[發明專利]一種新城疫病毒壓電免疫傳感檢測方法

有效

• 申請號: 201610216481.9
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN105784846B
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發明（設計）人: 吳勝昔;王玲玲;蔡家利;羅彬彬;張中豪;胡夢云;蔣棚俊
• 申請（專利權）人: 重慶理工大學
• 主分類號: G01N29/12
• 分類號: G01N29/12
• 代理公司: 重慶博凱知識產權代理有限公司 50212
• 代理人: 李海華

本發明公開了一種新城疫病毒壓電免疫傳感檢測方法，1）先在石英晶體表面包被葡萄球菌A蛋白；2）再將制備的新城疫病毒單克隆抗體與葡萄球菌A蛋白結合，得到新城疫病毒壓電免疫傳感器；3）然后將新城疫病毒壓電免疫傳感器插入被檢樣品中，通過檢測儀檢測石英晶體是否出現諧振頻率變化，如出現諧振頻率變化，則說明被檢樣品中有新城疫病毒，否則被檢樣品中沒有新城疫病毒。本發明可實時在線檢測NDV，具有較高的敏感性和特異性，線性檢測范圍在2.56ng/ml?150ng/ml，40min內出現結果。本發明具有較高的敏感性、準確性，快速且低成本。

技術領域

本發明涉及獸醫生物制品學、免疫學及生物醫學工程中的病毒檢測，具體涉及一種新城疫病毒壓電免疫傳感檢測方法，屬于獸醫生物技術領域。

背景技術

新城疫(Newcastle Disease，ND)是一種急性、敗血性、高度接觸性一類動物疫病，其傳播迅速，發病率和死亡率高，一旦爆發疫情，將會給養禽業造成不可估量的損失。在《國家中長期動物疫病防治規劃(2012—2020)中，新城疫被列為優先防控的重大動物疫病之一。因此，動物疫控機構、動物衛生監督機構和養殖場非常重視新城疫的防控。

新城疫的診斷有多種方法，但均存在一定的局限。血凝-血凝抑制試驗(HA-HI)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)耗時長，特異性不強，程序相對復雜；雞胚病毒分離方法是一種敏感特異的方法，但整個過程約需3周左右，且操作煩瑣，不利于現場檢疫或監測；CN1827775A(專利申請號為200510008997.6)“檢測新城病毒的核苷序列、試劑盒及檢驗方法”，該發明選擇新城疫病毒F基因(合成F蛋白)作為靶區域，選擇能夠反映裂解位點特性且缺乏二級結構的保守區設計多對引物和探針，建立熒光PCR檢測新城疫病毒，該方法比傳統的PCR方法靈敏度高100-1000倍，但從樣品處理到出結果需要4小時左右，該方法的實施還需熒光定量PCR儀等昂貴儀器，不宜在基層推廣。因此，研究一種快速檢測新城疫病毒的診斷方法以便對疫情進行現場及時監控，已經是目前畜牧生產中急需解決的問題。

發明內容

針對現有技術存在的上述不足，本發明的目的在于提出一種新城疫病毒壓電免疫傳感檢測方法，本檢測方法具有較高的敏感性和特異性，可實時在線檢測，檢測快速。

本發明的技術方案是這樣實現的：

一種新城疫病毒壓電免疫傳感檢測方法，步驟如下，

1)先在石英晶體表面包被葡萄球菌A蛋白；

2)再將制備的新城疫病毒單克隆抗體與葡萄球菌A蛋白結合，得到新城疫病毒壓電免疫傳感器；

3)然后將新城疫病毒壓電免疫傳感器插入被檢樣品中，通過檢測儀檢測石英晶體是否出現諧振頻率變化，如出現諧振頻率變化，則說明被檢樣品中有新城疫病毒，否則被檢樣品中沒有新城疫病毒。

步驟1)在石英晶體表面包被葡萄球菌A蛋白時，將洗滌烘干后的石英晶體置于葡萄球菌A蛋白溶液中，在37℃保持30min即可，其中葡萄球菌A蛋白溶液濃度為0.2mg/ml。

步驟2)新城疫病毒單克隆抗體與葡萄球菌A蛋白結合時，將步驟1)表面包被有葡萄球菌A蛋白的石英晶體置于新城疫病毒單克隆抗體溶液中，在37℃保持30min即可，其中新城疫病毒單克隆抗體濃度為0.2mg/ml。

步驟3)檢測石英晶體是否出現諧振頻率變化的時間不低于30分鐘。

所述葡萄球菌A蛋白按如下方法提取，復蘇并培養金黃色葡萄球菌1.800菌株，收集菌液，采用溶解酶處理并離心，上清用飽和硫酸銨沉淀，PBS溶解后轉入透析袋透析；透析物用小鼠IgG-sephrose 4FF親和層析柱純化；吸附在柱上的SPA用0.1M，pH2.7鹽酸甘氨酸緩沖液洗脫；收集樣品，合并透析，濃縮后備用。