[發(fā)明專利]一種新城疫病毒壓電免疫傳感檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610216481.9
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN105784846B
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳勝昔;王玲玲;蔡家利;羅彬彬;張中豪;胡夢云;蔣棚俊
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶理工大學(xué)
• 主分類號: G01N29/12
• 分類號: G01N29/12
• 代理公司: 重慶博凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50212
• 代理人: 李海華

1.一種新城疫病毒壓電免疫傳感檢測方法，其特征在于：步驟如下，

1）先在石英晶體表面包被葡萄球菌A蛋白；

2）再將制備的新城疫病毒單克隆抗體與葡萄球菌A蛋白結(jié)合，得到新城疫病毒壓電免疫傳感器；

3）然后將新城疫病毒壓電免疫傳感器插入被檢樣品中，通過檢測儀檢測石英晶體是否出現(xiàn)諧振頻率變化，如出現(xiàn)諧振頻率變化，則說明被檢樣品中有新城疫病毒，否則被檢樣品中沒有新城疫病毒；

所述葡萄球菌A蛋白按如下方法提取，復(fù)蘇并培養(yǎng)金黃色葡萄球菌1.800菌株，收集菌液，采用溶解酶處理并離心，上清用飽和硫酸銨沉淀，PBS溶解后轉(zhuǎn)入透析袋透析；透析物用小鼠I g G-sephrose 4FF 親和層析柱純化；吸附在柱上的SPA用0.1M，pH2.7 鹽酸甘氨酸緩沖液洗脫；收集樣品，合并透析，濃縮后備用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新城疫病毒壓電免疫傳感檢測方法，其特征在于：步驟1）在石英晶體表面包被葡萄球菌A蛋白時，將洗滌烘干后的石英晶體置于葡萄球菌A蛋白溶液中，在37℃保持30min即可，其中葡萄球菌A蛋白溶液濃度為0.2mg/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新城疫病毒壓電免疫傳感檢測方法，其特征在于：步驟2）新城疫病毒單克隆抗體與葡萄球菌A蛋白結(jié)合時，將步驟1）表面包被有葡萄球菌A蛋白的石英晶體置于新城疫病毒單克隆抗體溶液中，在37℃保持30min即可，其中新城疫病毒單克隆抗體濃度為0.2mg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新城疫病毒壓電免疫傳感檢測方法，其特征在于：步驟3）檢測石英晶體是否出現(xiàn)諧振頻率變化的時間不低于30分鐘。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新城疫病毒壓電免疫傳感檢測方法，其特征在于：所述新城疫病毒單克隆抗體按如下方法制備，復(fù)蘇新城疫病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株4E11，培養(yǎng)至其對數(shù)生長期，取12周齡的BALB/ c小鼠若干只，并分別腹腔注射弗氏不完全佐劑，0.2-0.3ml/只；3天后腹腔接種用無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細胞，每只小鼠1—3×10⁶/0.3ml；間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可采集腹水，純化即得新城疫病毒單克隆抗體。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新城疫病毒壓電免疫傳感檢測方法，其特征在于：步驟3）檢測石英晶體諧振頻率是否變化時，以新城疫病毒標準抗原作陽性對照，禽流感病毒作陰性對照，PBS液作空白對照。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新城疫病毒壓電免疫傳感檢測方法，其特征在于：將不同的新城疫病毒壓電免疫傳感器對應(yīng)插入抗原濃度不同但已知的標準抗原中，檢測不同濃度標準抗原下石英晶體剛插入時的初始諧振頻率及諧振頻率穩(wěn)定時的穩(wěn)定諧振頻率，得到不同濃度對應(yīng)的頻率差，即頻移值，進而得到抗原濃度與頻移值的關(guān)系曲線；然后再進行步驟3），如石英晶體出現(xiàn)頻率變化，進一步確定被檢樣品對應(yīng)的頻移值，根據(jù)抗原濃度與頻移值的關(guān)系曲線，即可得到被檢樣品中新城疫病毒濃度。