[發明專利]一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法

有效

• 申請號: 201610215547.2
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN105647911B
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 楊巧麗;滾雙寶;馬艷萍
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 馬英

本發明公開了一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法包括：1）組織破碎和DNA保護；2）組織裂解液消化；3）Tris?飽和酚抽提；4）Tris?飽和酚和氯仿異戊醇混合抽提；5）氯仿異戊醇抽提；6）NaAc和充分預冷（?20℃）的無水乙醇沉淀DNA；7）乙醇漂洗；8）TE緩沖液溶解DNA、保存。本發明顯著提高了DNA的得率（DNA濃度112~851 ng/μL），同時節省了DNA提取時在破碎細胞后加蛋白酶K進行消化過夜（≥12h）的時間，從組織破碎到基因組DNA提取完成總耗時約3h。

技術領域

本發明涉及一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

基因組DNA提取是開展分子生物學研究的一項重要技術環節，并被廣泛地應用于種質資源評價及育種研究，為便于查找動物的血緣關系和管理記錄，在動物出生后往往采用剪耳缺法對每個個體進行編號，此時采集耳缺組織可滿足大樣本量的研究且不傷害的動物健康。目前從哺乳動物組織中提取基因組DNA的方法通常采用傳統的酚-氯仿抽提法和試劑盒法，前者在組織破碎后直接進行蛋白酶K消化處理，耗時長（≥12h），細胞破碎不充分；后者價格昂貴，且由于耳組織含有少量被毛，難消化，DNA提取濃度低，因此均不適用于大樣本量研究的提取。面對大量的研究個體和樣本，快速、高效的耳組織基因組DNA提取方法將有利于提高研究效率。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有基因組DNA提取方法存在的DNA提取濃度低或耗時長等缺陷，提供一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法。

本發明采用以下技術方案：

一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法，該方法的具體步驟如下：

1）組織破碎：取組織樣于滅菌離心管中，剪碎；快速加入預冷的TE裂解液，盡可能使細胞充分破碎制成溶漿并對溶漿中DNA進行保護；

2）組織裂解液消化；

3）Tris飽和酚抽提；

4）Tris飽和酚和氯仿異戊醇混合抽提；

5）氯仿異戊醇抽提；

6）醋酸鈉和 -20℃ 預冷的無水乙醇沉淀DNA；

7）乙醇漂洗；

8）TE 緩沖液溶解DNA、保存。

步驟1）中所述TE裂解液的組成為：pH8.0的10mM Tris-HCl 和pH8.0的2mM EDTA。

本發明的優點在于：在組織剪碎后快速加入預冷的TE裂解液，通過其成分中稍高的EDTA組分濃度抑制脫氧核酸酶對DNA的降解作用，顯著提高了DNA的得率（DNA濃度112~851 ng/μL，TE 成分中1mM EDTA組份濃度時提取的DNA濃度40~160 ng/μL），并結合預冷的緩沖體系保護了DNA的完整性；Tris-飽和酚反復抽提有效去除蛋白質，節省了在消化過程中加蛋白酶K消化蛋白質的時間（≥12h），本發明提取DNA過程耗時約3h。

附圖說明

圖1為本發明提取的哺乳動物耳組織基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；

圖2為現有技術的TE緩沖液成分中1mM EDTA (pH8.0)組份濃度時提取的哺乳動物耳組織基因組DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；

電泳條件：1 μL DNA提取樣品與1.0 μL 6 × Buffer上樣緩沖液混勻，加樣于1.0%的瓊脂糖凝膠，100 V電壓，電泳30 min。

圖1中的基因組DNA條帶清晰明亮，沒有降解，即該方法提取的DNA完整性好、質量高。圖2中的基因組DNA明顯不如圖1的清晰明亮，有輕微的拖帶現象，說明有DNA降解。