[發(fā)明專利]用于非治療目的的肥厚型心肌病相關(guān)致病基因突變的篩查方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610213537.5
• 申請(qǐng)日: 2016-04-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105695606B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏雪山;趙躍;馮悅;宋玉竹;丁家桓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;侯瀟瀟

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于非治療目的的肥厚型心肌病相關(guān)致病基因突變的篩查方法，所述方法包括如下步驟：(1)提取基因組；(2)采用多重PCR擴(kuò)增靶基因；(3)靶基因文庫(kù)構(gòu)建；(4)對(duì)靶基因文庫(kù)通過(guò)下一代半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，篩查出與肥厚型心肌病發(fā)病相關(guān)的基因突變位點(diǎn)。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便快捷，成本低，且一次性檢測(cè)多個(gè)樣本，為肥厚型心肌病的篩查奠定了基礎(chǔ)，為臨床分子診斷開(kāi)拓了道路。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)分子診斷及生物技術(shù)，具體涉及用于非治療目的的肥厚型心肌病相關(guān)致病基因突變的篩查方法。

背景技術(shù)

肥厚型心肌病(HCM)為一種最常見(jiàn)的遺傳性心臟疾病，主要表現(xiàn)為左心室不對(duì)稱性肥厚或心肌壁增厚，較少患者表現(xiàn)出左室流出道梗阻、右心室肥厚或雙心室肥厚。病理特征為心肌細(xì)胞彌漫性肥大、畸形、核大、深染和心肌纖維紊亂等。HCM臨床表現(xiàn)從無(wú)征兆到呼吸困難、暈厥、胸痛甚至發(fā)生心源性猝死和致命性的心律失常。

HCM是第一個(gè)從遺傳角度闡明病因的遺傳性心臟疾病。1990年在一個(gè)加拿大家族性肥厚型心肌病患者中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)致病基因MYH7，其遵循的是常染色體顯性遺傳模式。HCM的全球發(fā)病率和年死亡率分別約為1/500和1％。相關(guān)證據(jù)表明，Zou等人隨機(jī)抽查中國(guó)9個(gè)省的成年人8080人，其中男性4064人，女性4016人，并對(duì)其進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，結(jié)果表明中國(guó)人群患HCM的概率大約為0.8/500。實(shí)際上，超聲心動(dòng)圖對(duì)肥厚型心肌病的檢測(cè)為一種患病后的診斷方式，還存在更多潛在的HCM患者，依此推斷，中國(guó)人群中至少存在200萬(wàn)HCM患者。該病也是是青少年和年輕運(yùn)動(dòng)員猝死的最主要原因之一，Morn等人對(duì)1986-2006年猝死的1886名美國(guó)年輕運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，死亡的主要原因?yàn)樾难芗膊?056名，占約56％，其中HCM的患者就占據(jù)了36％。

相關(guān)研究表明，HCM主要由肌節(jié)基因突變所致，故HCM又稱為肌小節(jié)疾病。HCM主要遵循常染色體顯性遺傳模式，常染色體隱性遺傳較少，大約有50％的HCM患者為家族性遺傳，稱為家族性肥厚型心肌病(FHCM)。HCM具有高度的臨床遺傳異質(zhì)性，到目前為止，發(fā)現(xiàn)的與HCM發(fā)病相關(guān)的致病基因大約有30個(gè)，致病性突變位點(diǎn)超過(guò)1400個(gè)，但約80％的HCM患者的致病基因主要發(fā)生在編碼粗肌絲、細(xì)肌絲或能量代謝蛋白的基因上，這些基因?yàn)椋篗YH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、MYH6、TPM1、ACTC1、PRKAG2、MYL2和MYL3。肌節(jié)蛋白突變導(dǎo)致HCM的機(jī)制還不太清楚，目前認(rèn)為肌節(jié)蛋白基因突變后導(dǎo)致粗肌絲或細(xì)肌絲對(duì)Ca²⁺的親和力和敏感性加強(qiáng)，過(guò)度消耗了細(xì)胞內(nèi)的能量，心肌細(xì)胞供能不足，觸發(fā)了心肌細(xì)胞的死亡，導(dǎo)致心肌細(xì)胞電傳導(dǎo)能力受損，從而表現(xiàn)出心室肌肥厚。

對(duì)肥厚型心肌病患者進(jìn)行基因檢測(cè)和家族篩查能夠?yàn)榕R床診斷提供重要的指導(dǎo)作用，主要體現(xiàn)為：1)產(chǎn)前診斷，指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育；2)輔助明確診斷，進(jìn)行臨床干預(yù)；3)家族篩查，進(jìn)行家族疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及管理。

肥厚型心肌病最大特點(diǎn)為臨床遺傳異質(zhì)性，致病基因較多，致病性突變位點(diǎn)已經(jīng)接近1400個(gè)。CN 102965428A公開(kāi)了及一種檢測(cè)遺傳性心肌肥厚相關(guān)基因突變樣品制備試劑盒。該試劑盒包括a)獨(dú)特設(shè)計(jì)并制備捕獲探針，針對(duì)基因ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、PRKAG2、RAF1、SOS1、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、VCL全部外顯子片段；b)設(shè)計(jì)帶有獨(dú)特標(biāo)簽序列的接頭；c)通用引物對(duì)探針序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增；d)設(shè)計(jì)獨(dú)特的混合后目的片段的捕獲操作。該申請(qǐng)采用探針捕獲測(cè)序，與其他傳統(tǒng)的DNA芯片雜交和毛細(xì)管電泳測(cè)序技術(shù)一樣，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且價(jià)格昂貴，根本不能滿足對(duì)肥厚型心肌病的基因檢測(cè)。