[發(fā)明專利]用于非治療目的的肥厚型心肌病相關致病基因突變的篩查方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610213537.5
• 申請日: 2016-04-07
• 公開（公告）號: CN105695606B
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發(fā)明（設計）人: 夏雪山;趙躍;馮悅;宋玉竹;丁家桓
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;侯瀟瀟

1.用于非治療目的的肥厚型心肌病相關致病基因突變的高通量篩查方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取基因組；

(2)采用多重PCR擴增靶基因，所述靶基因包括MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、MYH6、TPM1、ACTC1、PRKAG2、MYL2和MYL3全部外顯子片段的編碼區(qū)及其附近不少于50bp的非編碼區(qū)；

(3)靶基因文庫構(gòu)建；

(4)對靶基因文庫通過下一代半導體測序平臺314半導體芯片進行測序，篩查出與肥厚型心肌病發(fā)病相關的基因突變位點，所述基因突變位點為MYH7-c.2155CT、MYH7-c.1987CT、MYH7-c.2654AC、MYBPC3-c.706AG、PRKAG2-c.298GA和TNNT2-c.887GA中的任意一種或至少兩種的組合；

所述多重PCR的引物如SEQ ID NO:1～172所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量篩查方法，其特征在于，步驟(1)所述的基因組來自于人的外周血、心肌組織、淋巴器官、脾臟、骨髓或肝臟中的任意一種或至少兩種的組合。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高通量篩查方法，其特征在于，步驟(2)所述多重PCR的反應體系為：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，10μM的上下游引物各2μL，模板DNA為2μL，所述模板DNA的濃度為250ng/μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 2μL，ddH₂O為30μL，終體積為50μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述多重PCR的反應條件為：

(a)98℃預變性3分鐘；

(b)98℃變性10秒，54或57℃退火15秒，68℃延伸1-3分鐘，共35個循環(huán)；

(c)68℃延伸5分鐘。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高通量篩查方法，其特征在于，所述方法還包括在步驟(2)所述多重PCR擴增靶基因后進行多重PCR產(chǎn)物純化及片段化。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高通量篩查方法，其特征在于，所述多重PCR產(chǎn)物純化包括如下步驟：對每個樣品各個區(qū)段的多重PCR產(chǎn)物進行定量，以等比例混合后，用磁珠進行純化。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述多重PCR產(chǎn)物片段化包括如下步驟：將純化后的產(chǎn)物進行定量后，通過核酸超聲破碎儀將片段將其打斷到150～250bp。