[發(fā)明專利]一種高效獲得重組蛋白的大腸埃希菌可溶性表達(dá)載體

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610210622.6
• 申請(qǐng)日: 2016-04-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107267539A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋永波;張景海
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽(yáng)藥科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/65;C12N15/66;C12N15/67
• 代理公司: 沈陽(yáng)杰克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司21207
• 代理人: 靳玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種原核生物表達(dá)體系，尤其是一種可高效、低成本地獲得重組蛋白的可溶性表達(dá)載體。

背景技術(shù)

在基因工程藥物研究中，由于大腸埃希菌具有遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，但不可避免地也存在著一定的缺點(diǎn)。雖然人們開(kāi)發(fā)出了多種表達(dá)體系，以克服大腸埃希菌表達(dá)產(chǎn)物中含有內(nèi)毒素、缺少翻譯后修飾、高表達(dá)時(shí)易折疊錯(cuò)誤等不足，但大腸埃希菌表達(dá)體系仍然是基因表達(dá)的重要工具。

在利用大腸埃希菌高水平表達(dá)外源基因，尤其是表達(dá)產(chǎn)物富含二硫鍵時(shí)，易于形成包涵體，而經(jīng)變性/復(fù)性后，正確折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量不穩(wěn)定，有時(shí)會(huì)很低，甚至有些蛋白尤其是高分子量的蛋白基本上不能正確折疊。雖然目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種可促進(jìn)的外源蛋白正確折疊、提高其產(chǎn)量的表達(dá)載體，但由于促進(jìn)蛋白正確折疊的生物分子，如分子伴侶DnaK、GroEL等，其分子量與某些目的蛋白相近，混入其中，導(dǎo)致所獲得蛋白的純度不高，而且各種促進(jìn)蛋白正確折疊的生物分子適用不同的目的蛋白。

一般情況下，利用基因重組技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)低成本、高效地獲取具有藥用價(jià)值的重組多肽或蛋白，但所獲得的蛋白純度不高、純化步驟繁瑣。通常采用親和標(biāo)簽與目的蛋白融合表達(dá)的方式來(lái)簡(jiǎn)化重組蛋白的分離純化步驟，但所獲得的目的蛋白的一端帶有親和標(biāo)簽。而對(duì)于很多蛋白質(zhì)藥物而言，藥典規(guī)定其不能含有親和標(biāo)簽，故親和標(biāo)簽的去除又成為了一個(gè)難題。目前，常見(jiàn)的親和標(biāo)簽去除方法有化學(xué)法切割和酶法切割。其中，化學(xué)法切割對(duì)目的蛋白的活性影響較大，酶法切割成本較高，均不適合大規(guī)模應(yīng)用。

綜合來(lái)看，目前還沒(méi)有一種載體能夠在保證目的蛋白正確折疊的情況下通過(guò)自我剪切獲得不含任何標(biāo)簽的目的蛋白的低成本、高收率的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種可高效獲得重組蛋白的大腸埃希菌可溶性表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，利用該載體進(jìn)行外源蛋白的表達(dá)克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的外源蛋白表達(dá)量少、純度低、操作步驟多、以包涵體形式表達(dá)的缺陷。

本發(fā)明解決當(dāng)前技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

所述的高效獲得重組蛋白的大腸埃希菌可溶性表達(dá)載體通過(guò)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)外源蛋白質(zhì)表達(dá)，載體結(jié)構(gòu)中同時(shí)含有內(nèi)含肽基因與硫氧還蛋白基因，且所表達(dá)的內(nèi)含肽與硫氧還蛋白用六聚組氨酸標(biāo)記。其結(jié)構(gòu)基因，按順序?yàn)榱劢M氨酸標(biāo)簽-柔性連接肽-幾丁質(zhì)結(jié)合域-內(nèi)含肽復(fù)合體編碼基因、外源目的基因、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、硫氧還蛋白-柔性連接肽-六聚組氨酸標(biāo)簽復(fù)合體編碼基因。

本發(fā)明的表達(dá)載體通過(guò)如下方法構(gòu)建：分別獲取內(nèi)含肽與硫氧還蛋白的核酸序列，通過(guò)設(shè)計(jì)合適的引物，對(duì)兩個(gè)基因(內(nèi)含肽和硫氧還蛋白)的核酸序列進(jìn)行優(yōu)化和修飾，以市售的通用型表達(dá)載體為母核，通過(guò)酶切、酶連，獲得特征結(jié)構(gòu)序列依次為六聚組氨酸標(biāo)簽-柔性連接肽-幾丁質(zhì)結(jié)合域-內(nèi)含肽復(fù)合體編碼基因、外源目的基因、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、硫氧還蛋白-六聚組氨酸標(biāo)簽復(fù)合體編碼基因的重組可溶性表達(dá)載體。其中，將六聚組氨酸標(biāo)簽-柔性連接肽-幾丁質(zhì)結(jié)合域-內(nèi)含肽復(fù)合體命名為I復(fù)合體蛋白，硫氧還蛋白-六聚組氨酸標(biāo)簽復(fù)合體命名為H復(fù)合體蛋白，整個(gè)載體命名為pSYPU-IH。

其中，在內(nèi)含肽基因序列的5'端依次連接上幾丁質(zhì)結(jié)合域基因、柔性連接肽基因、六聚組氨酸標(biāo)簽基因。

在硫氧還蛋白基因3'端進(jìn)行六聚組氨酸基因標(biāo)記。

所述的外源目的基因的結(jié)構(gòu)中含有二硫鍵。

所用的限制性核酸內(nèi)切酶為BspI、BamHI，宿主菌為BL21。

外源目的基因與硫氧還蛋白基因非融合表達(dá)。

本發(fā)明的有益效果是：①利用結(jié)構(gòu)中含內(nèi)含肽的I蛋白的高效自我切割能力，簡(jiǎn)化操作步驟，可獲得不帶有親和標(biāo)簽的外源目的蛋白。②利用結(jié)構(gòu)中含硫氧還蛋白的H復(fù)合體蛋白與目的蛋白在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位中非融合表達(dá)，促進(jìn)目的蛋白正確折疊，獲得表達(dá)量高、有生物活性的目的蛋白，低成本地解決了大腸埃希菌基因工程表達(dá)產(chǎn)物易形成包涵體的問(wèn)題。同時(shí)，通過(guò)親和標(biāo)簽介導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)硫氧還蛋白的柱上結(jié)合，避免其混入，提高目的蛋白質(zhì)的純度。③應(yīng)用價(jià)值高，可適用于規(guī)模化生產(chǎn)。

總體來(lái)看，該表達(dá)載體是一種能夠在保證目的蛋白正確折疊的情況下通過(guò)自我剪切獲得不含任何標(biāo)簽的目的蛋白的低成本、高收率的良好工具。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

圖1為可溶性表達(dá)載體pSYPU-IH的構(gòu)建及特征圖譜

圖1-1：(his tag)₆-柔性連接肽-CDB-Intein基因獲取；