[發(fā)明專利]一種同步檢測百合隱癥病毒、斑駁病毒和黃瓜花葉病毒的方法

在審

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• 申請日: 2016-04-07
• 公開（公告）號: CN105695636A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設計）人: 張玉寶;王亞軍;劉維;謝忠奎;王若愚;楊果;郭志鴻
• 申請（專利權）人: 中國科學院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
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技術領域

本發(fā)明涉及一種同步檢測百合隱癥病毒、斑駁病毒和黃瓜花葉病毒的方法，更進 一步涉及一種用免疫捕獲三重RT-PCR技術同步檢測百合隱癥病毒、斑駁病毒和黃瓜花葉病 毒的方法。

背景技術

百合病毒自20世紀40年代被發(fā)現(xiàn)以來，已成為危害百合種球生產和鮮切花品質的 世界性病害；至今被發(fā)現(xiàn)侵染百合病毒有20多種，其中百合隱癥病毒(Lilysymptomless virus，LSV)、百合斑駁病毒(Lilymottlevirus，LMoV)和黃瓜瓜花葉病毒（Cucumber mosaicvirus,CMV）是發(fā)生較普遍、危害嚴重的3種病毒。

LSV屬于香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)，是正義單鏈RNA病毒；LSV基因組為 不分段RNA，全長為8394bp，5′端含帽子結構，3′端有polyA尾巴，共有6個開放閱讀框 (ORF)，編碼4個蛋白，依5′至3′分別編碼：RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)，三基因連鎖 結構(TGBp1-3)，外殼蛋白(CP)和核酸結合蛋白；LSV的ORF1為RdRp，編碼一個蛋白(220 kD)，與病毒在植物體內復制有關；ORF2、ORF3和ORF4分別編碼TGBp1、TGBp2和TGBp3 (25kD，12kD，7kD)，是病毒在宿主體內運動的3個基因序列互相重疊的運動蛋白(MP)； ORF5為CP，編碼唯一參與病毒顆粒形態(tài)構成的蛋白質(32kD)；ORF6推測是核酸結合蛋白(16 kD)，該蛋白含有一個CysZ-CysZ結構的鋅指結構域。

LMoV屬于馬鈴薯Y病毒科、馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），病毒粒子為彎曲線狀且呈 螺旋對稱，大?。?50～900）nm×（11～15）nm；病毒基因組為單分子正鏈RNA，約9.4kb，具有 potyvirus屬成員的典型基因組結構特征，包括一個Poly（A）尾巴，編碼一個由3095個氨基 酸組成的分子量為351.0kDa的多聚蛋白；多聚蛋白通過自我剪切后形成外殼蛋白（CP）等 10個不同大小的功能蛋白；LMoVCP亞基由274aa組成，大小為30kDa左右，組裝成外殼包裹 病毒RNA。

CMV是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的典型成 員，在世界范圍內均有分布，宿主范圍遍布于雙子葉植物和單子葉植物，已經闡明的就多達 1000種以上；CMV病毒顆粒分子量在5000～67000kDa之間，病毒體RNA含量占18%，蛋白質含 量82%，衣殼蛋白分子量為24.5KDa；A260/A280大約1.7；病毒顆粒為正20面體球狀，直徑28 ～30nm；RNA由四條RNA分子組成，RNA1和RNA2被分別包被，RNA3和RNA4則被包被于同一衣 殼中。

防治百合病毒病較有效的手段是采用無毒繁殖材料或進行脫毒快繁，而這有賴于 靈敏、快速和可靠的檢測技術；基于病毒外殼蛋白抗原抗體反應的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 和基于病毒核酸的RT-PCR檢測是目前較為廣泛的檢測病毒的方法；然而，ELISA檢測一個反 應體系只能完成一種病毒的檢測，不能實現(xiàn)同步檢測多種病毒；RT-PCR雖然可以對多種病 毒實現(xiàn)同步檢測，但是檢測必須提取高質量的RNA，百合以及水仙、郁金香等球莖花卉種球 富含多酚和多糖，提取的RNA中殘留多酚和多糖會嚴重影響檢測的靈敏性和特異性；免疫捕 獲RT-PCR或IC-RT-PCR結合了ELISA和RT-PCR另種方法的優(yōu)點，具有較高的靈敏度，且更加 簡便高效，更重要的是不用提取RNA，檢測成本低，不受多糖多酚的影響，非常適合百合、水 仙、郁金香種球的病毒檢測；關于免疫捕獲RT-PCR，目前已有用該方法檢測多種植物病毒的 相關報道，但是已建立的檢測體系都僅能完成一種單一病毒的檢測，至今未見用該方法同 步檢測兩種或多種病毒的相關報道。

為了進一步提高檢測效率，降低試驗成本，本發(fā)明對現(xiàn)有的免疫捕獲RT-PCR反應 進行了改進，實現(xiàn)了用該方法同步檢測百合隱癥病毒、斑駁病毒和黃瓜花葉病毒；具體是在 免疫捕獲RT-PCR反應的第一部分將通常單一的免疫反應改進為復合的免疫反應，即PCR管 壁上同時捕獲LSV、LMoV和CMV粒子；第二部分將第一鏈cDNA的合成改進為第一鏈cDNAs混合 物的合成；第三部分將單一的PCR反應改進為了三重PCR檢測。

發(fā)明內容