[發明專利]藍色4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染料示蹤基因納米載體的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201610209494.3
• 申請日: 2016-04-05
• 公開（公告）號: CN105779503A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 常津;鄭斌;王漢杰;諶紅彬;胡鵬飛;潘慧卓
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

技術領域

本發明涉及一種可實時跟蹤外源基因的納米載體的制備方法及其應用，屬生物技術 和醫藥技術領域。

背景技術

基因轉染是一種非常常規的生物和醫藥技術，但是通常的基因轉染用的試劑是相對 分子質量為25,000的聚醚酰亞胺(PEI)，雖然該PEI比相對分子質量為600的PEI的 轉染效率高，但是其細胞毒性也比相對分子質量為600的PEI大得多，因此將相對分子 質量為600的PEI連接至一納米微球上便可以成功制備出一種轉染效率高，細胞毒性低 的新型基因轉染載體。

此外，用常規的基因轉染試劑進行轉染細胞時，很難方便的示蹤基因載體的具 體位置，也就無法判定目標細胞是否有外源基因的的進入。于是可以通過先合成一 種含有介孔的納米基因載體，然后裝載有機染料(如可以對細胞核進行著色的DAPI 染料)來對細胞核進行著色，以達到示蹤基因載體和對靶向細胞著色的目的，并評 估目的基因是否進入了靶向細胞。因此，研制出一種具有轉染效率高，細胞毒性小， 并且可以實時跟蹤外源基因的納米載體等優勢的新型基因載體具有重大的意義，在生 物技術和醫藥技術領域具有重要的科研和臨床應用前景。

發明內容

根據現有技術的不足，我們提出具有轉染效率高，細胞毒性小，并且可以實時 跟蹤外源基因的納米載體等優勢的新型基因載體的制備方法。

本發明的技術方案包括：介孔硅殼納米顆粒表面連接分子量大小為600的低分子量 聚醚酰亞胺(PEI)。藍色4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染料染料的包埋:將DAPI染料包埋 至介孔二氧化硅納米的介孔中。

本發明的優勢：1)具有較高的基因轉染效率。2)具有較低的細胞毒性。3)可以通 過觀察納米載體內DAPI染料的分布情況來實時跟蹤基因所到達的位置。

具體技術方案如下：

一種藍色4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染料示蹤基因納米載體的制備方法；其特征是 步驟如下：

1)稱取介孔二氧化硅納米顆粒用無水吡啶配制成1～100毫克每毫升的溶液，加入 質量比為1:3～1:30的丁二酸酐，在磁力攪拌條件下，攪拌反應6～12小時，得到羧基 化的介孔二氧化硅納米顆粒；

2)將羧基化的介孔二氧化硅納米顆粒溶解于去離子水中；加入質量比為1:1～1:10、 相對分子質量為600的聚醚酰亞胺，并在磁力攪拌條件下，攪拌反應6～12小時；待反 應結束后，用去離子水洗滌沉淀1～3遍，得到可吸附DNA的基因納米載體；

3)將基因納米載體配成1～10毫克每毫升的水溶液，然后加入與基因納米載體的 質量比為1:2～1:20的藍色4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染料，在磁力攪拌條件下，攪拌 反應6～12小時；待反應結束后，用去離子水洗滌沉淀1～3遍，得到實時跟蹤外源基 因的介孔二氧化硅基因納米載體。

制備的藍色4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染料示蹤基因納米載體，直徑為80～150納 米，孔徑為0.5～2納米，載藥率為20～40％。

本發明的方法制備的藍色4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染料示蹤基因納米載體，其基 因轉染效率為40～70％，細胞存活率為80％～95％。

本發明可通過觀察納米載體內藍色4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染料的分布情況來實 時跟蹤基因所到達的位置。

具體說明如下：

介孔二氧化硅基因納米載體的步驟如下：

1)介孔二氧化硅納米顆粒的羧基化：取一干凈的小玻璃瓶，向其中量取濃度為5～ 10毫克/毫升，直徑為80～150納米，孔徑為0.5～2納米的介孔二氧化硅納米顆粒。然 后加入10～100毫克的丁二酸酐，以50～100W的功率超聲溶解丁二酸酐，最后于100～ 500轉/分鐘，15～50℃條件下攪拌反應6～12小時。待反應結束后，以9,000～11,000 轉/分鐘，離心5～20分鐘，并用去離子水洗滌沉淀1～3遍。

2)介孔硅殼納米顆粒表面連接聚醚酰亞胺(PEI)：將步驟1)中羧基化的介孔二氧 化硅納米顆粒溶解至2～5毫升的去離子水中并轉移至一10毫升的玻璃瓶中，然后加入 30～200微升，相對分子質量為600的聚醚酰亞胺(PEI)，并于100～500轉/分鐘，，15～ 50℃條件下攪拌反應6～12小時。待反應結束后，以9,000～11,000轉/分鐘，離心5～ 20分鐘，并用去離子水洗滌沉淀1～3遍，即得到可以吸附DNA的基因納米載體。