[發(fā)明專利]一種基于核酸適配體和納米模擬酶檢測卡那霉素殘留的電化學檢測方法

有效

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• 申請日: 2016-04-06
• 公開（公告）號: CN105784799B
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周楠迪;王春帥;田亞平
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N27/30
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務(wù)所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

一種基于核酸適配體和納米模擬酶檢測卡那霉素殘留的電化學檢測方法，屬于分析化學技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用酪氨酸還原氯金酸合成金納米顆粒，催化過氧化氫與還原態(tài)的硫堇發(fā)生反應(yīng)生成氧化態(tài)的硫堇，后者可通過差分脈沖伏安法進行檢測。用卡那霉素特異性適配體對金納米顆粒進行修飾，該適配體吸附于金納米顆粒表面而抑制了其過氧化物酶活性。當目標物卡那霉素存在時，能將適配體從金納米顆粒表面競爭置換下來形成復合物，從而恢復其過氧化物酶活性。利用差分脈沖伏安法檢測氧化態(tài)硫堇的還原峰電流值和抗生素濃度之間的關(guān)系可實現(xiàn)對卡那霉素的檢測。本發(fā)明提供的方法具有良好的重復性、穩(wěn)定性和高靈敏度，可用于食品樣品中卡那霉素殘留的有效檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于核酸適配體和納米模擬酶檢測卡那霉素殘留的電化學檢測方法，屬于分析化學技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

卡那霉素（kanamycin）是一種廣譜型氨基糖甙類抗生素，分子式C₁₈H₃₈N₄O₁₅S，分子量582.58。卡那霉素主要由灰色鏈霉菌或小單胞菌發(fā)酵液中提取或以天然品為原料半合成提取。卡那霉素硫酸鹽作為一種水溶性的抗生素，對許多革蘭氏陰性細菌包括沙門氏菌、肺結(jié)核桿菌和某些革蘭氏陽性菌有療效，因其價格低廉，用藥方便，抗菌譜廣被廣泛用作人畜共用藥，效果優(yōu)良。在農(nóng)業(yè)，畜牧業(yè)，水產(chǎn)業(yè)中卡那霉素不僅可以治療各種感染類疾病，同時還可以促進畜禽生長，提高經(jīng)濟效益。但是不合理使用卡那霉素會導致動物源性食品中卡那霉素的殘留，通過生物循環(huán)系統(tǒng)進入人體，引起人體不同程度的損害，伴隨而來的是對公眾健康和環(huán)境的潛在危害。各國政府機構(gòu)根據(jù)其經(jīng)濟發(fā)展水平對動物源性食品中抗生素殘留的最大允許殘留限量（MRL）做了明確規(guī)定，目前我國規(guī)定牛乳中卡那霉素的MRL≤200μg?kg^-1。

傳統(tǒng)的卡那霉素殘留檢測方法有微生物檢測法和儀器檢測法，后者包括氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、液-質(zhì)聯(lián)用法（HPLC-MS）、液相色譜-串極質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）、紫外分光光度計法（UV）、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）等。微生物檢測法應(yīng)用較為廣泛，其優(yōu)點是費用低，一般實驗室都能操作，但測定時間長，結(jié)果誤差較大，操作復雜，不能適應(yīng)特異性、定量檢測的需求。儀器檢驗方法是利用卡那霉素結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)來進行分離和定性定量測定，其準確性好，但往往設(shè)備昂貴，對實驗人員也有較高的要求，對樣品的預處理要求較高，分析費時而不易推廣。因而，建立操作簡單便攜，特異性好，靈敏度高的卡那霉素檢測方法，對加強動物源食品中卡那霉素殘留的監(jiān)控，保障食品安全具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是將納米生物技術(shù)、核酸適配體及電化學檢測等諸多技術(shù)的優(yōu)勢聯(lián)合起來，建立一種簡便快速而又具有極高靈敏度的卡那霉素殘留分析方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案，一種基于核酸適配體和金納米顆粒模擬酶的卡那霉素殘留的檢測方法，將金納米顆粒與卡那霉素特異性適配體孵育，適配體ssDNA附著在金納米顆粒表面，從而使得其過氧化物酶活性受到抑制，當加入含有卡那霉素的樣品溶液時，卡那霉素與其適配體親和力大于適配體和金納米顆粒的結(jié)合力，卡那霉素與其適配體特異性競爭結(jié)合形成復合物，使得金納米顆粒表面重新暴露，從而恢復相應(yīng)的過氧化物酶活性，催化反應(yīng)體系中的過氧化氫和還原態(tài)(red)硫堇發(fā)生反應(yīng)生成氧化態(tài)(ox)硫堇；具體反應(yīng)式如下：

納米模擬酶：H₂O₂+硫堇 (red)→H₂O +硫堇(ox) (1)

電極反應(yīng)：硫堇(ox)+2e^-+2H⁺→硫堇(red) (2)

通過差分脈沖伏安法對氧化態(tài)的硫堇進行測定，所得峰電流與卡那霉素濃度間存在線性關(guān)系，從而可以對卡那霉素進行定量分析，具體原理如圖1所示。