[發明專利]一種基于核酸適配體和納米模擬酶檢測卡那霉素殘留的電化學檢測方法

有效

• 申請號: 201610206929.9
• 申請日: 2016-04-06
• 公開（公告）號: CN105784799B
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發明（設計）人: 周楠迪;王春帥;田亞平
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N27/30
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

1.一種基于核酸適配體和納米模擬酶檢測卡那霉素殘留的電化學檢測方法，其特征在于具體步驟如下：

（1）金納米顆粒模擬酶的制備：利用酪氨酸作為還原劑和捕獲劑制備而成金納米顆粒模擬酶：將含有0.1~0.5mM酪氨酸和0.1~0.5 mM KOH的300mL超純水溶液煮沸3~5min，立即加入1.02mL質量體積比為1%~3%的氯金酸溶液并在沸水浴中保溫5~10min；繼續在沸水浴中持續沸騰至溶液體積減少至30mL，得到不同粒徑的金納米顆粒溶液；將上述金納米顆粒溶液提前在沸水中處理過的截留分子量為12 kDa的透析袋中透析除去多余的KOH、金屬離子及酪氨酸，得金納米顆粒模擬酶，置于4℃冰箱中保存備用；

（2）功能化金納米顆粒的制備：

a、適配體的預處理：

卡那霉素適配體的序列為：5’-TGGGGGTTGA GGCTAAGCCG A-3’；

將上述適配體稀釋到600 nM，在95℃保溫10~15min使適配體變性后，立即將其轉移到冰浴中5~10min，最后恢復至室溫備用；

b、孵育：將上述處理過的適配體溶液與步驟（1）制備得到的等體積的金納米顆粒模擬酶溶液在室溫下孵育20~30min，適配體即通過含氮堿基穩定附著在金納米顆粒表面；

c、后處理：將步驟b所得混合溶液在4℃，8000rpm條件下離心10min，以除去未結合的適配體，并重懸于等體積的pH 4.0，0.2 mM HAc-NaAc緩沖液中，得到功能化的金納米顆粒溶液；

（3）卡那霉素樣品與功能化金納米顆粒的置換反應以及金納米模擬酶的催化反應：往1mL步驟（2）所得功能化的金納米顆粒溶液中加入pH 4.0 0.2mM HAc-NaAc的緩沖液4mL，然后將不同濃度的卡那霉素待測樣品加入到上述體系中；加入0.998 M，20μL的底物過氧化氫，和購買得到的還原態的硫堇粉末用超純水配制成的2mM的硫堇溶液50μL，在25~60℃水浴中反應20min；

（4）電化學測定：

d、電極預處理：用0.5μm及0.05μm的氧化鋁粉末在拋光布上先后打磨金電極表面；然后對金電極進行40Hz超聲清洗，依次用超純水、無水乙醇、超純水分別超聲處理3~5min，最后一次用超純水清洗后，氮氣吹干金電極表面；將金電極作為工作電極，鉑絲電極作為對電極，Ag/AgCl作為參比電極以構建三電極體系；將電極置于0.5 mol/L的H₂SO₄溶液中在-0.2~1.5 V電位范圍內以100 mV/s的掃描速度循環掃描，于0.8V的峰值不再增加即為清洗完成；用超純水沖洗金電極表面3次，氮氣吹干，使金電極表面光滑干凈完成電極的預處理；

e、測定：采用差分脈沖伏安法進行電化學檢測，將步驟d預處理后的金電極置于步驟（3）所得催化反應液中，記錄不同卡那霉素濃度下納米模擬酶催化產生氧化態硫堇的電流值，建立峰電流與卡那霉素濃度間的線性關系，從而實現對卡那霉素的檢測；

（5）樣品檢測：采用差分脈沖伏安法對反應體系中的氧化態硫堇進行電化學檢測，該方法具體參數設置為：電壓范圍0.3V~ -0.3V，電壓增量4 mV，振幅50 mV，脈沖寬度0.05 s，采樣寬度0.0167 s，脈沖周期0.05 s，靜置時間2 s；取待檢測的樣品，以步驟（1）-（4）同樣的步驟和試劑對其進行檢測，通過電流值得到待測樣品中的卡那霉素濃度。

2.根據權利要求1所述基于核酸適配體和納米模擬酶檢測卡那霉素殘留的電化學檢測方法，其特征在于：所述樣品為牛奶或蜂蜜樣品。