[發明專利]一種用于檢測循環腫瘤細胞侵襲力的試劑盒

有效

• 申請號: 201610206075.4
• 申請日: 2016-04-05
• 公開（公告）號: CN105675870B
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 李靜;陳昌岳;蔡紅東;鄧文斌;甘廣利;張祥林
• 申請（專利權）人: 上海美吉生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;G01N33/574
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技術領域

本發明涉及免疫法檢測領域，具體地說是一種用于檢測循環腫瘤細胞侵襲力的試劑盒。

背景技術

循環腫瘤細胞(CTC)是指自發或因診療操作由實體瘤原發灶或轉移灶釋放進入外周血循環的腫瘤細胞。轉移是癌癥相關死亡的主要原因，而CTC被視為轉移的種子。CTC細胞是目前認為癌癥轉移的種子之一。對癌癥的早期診斷和預后都有重要的作用。但是我們在研究過程中發現，目前的CTC檢測方法無法區分有侵襲力和無侵襲力的CTC。由于CTC侵襲力不同，以致于當檢測到的CTC在5個以上后，CTC的個數和癌癥病人的生存期并不完全相對應。因此對于CTC的檢測分析，有必要區分有侵襲力和無侵襲力的CTC。

癌癥干細胞(CSC)又稱癌干細胞、腫瘤干細胞，是指具有干細胞的自我復制及多細胞分化性質的腫瘤細胞，可以作為腫瘤細胞侵襲力判斷的標志。

發明內容

本發明的主要目的是針對上述背景技術存在的不足提供一種用于檢測CTC侵襲力的試劑盒，能分析出CTC中CSC的表達量，從而進行CTC侵襲力的檢測。

本發明是通過如下技術方案實現的：一種用于檢測循環腫瘤細胞侵襲力的試劑盒，它包括：

CD133、CD24和CD44抗體各自獨立的與不同的寡核苷酸偶聯得到的抗體-寡核苷酸探針；

用于將上述抗體-寡核苷酸探針進行PCR擴增的擴增引物及緩沖液；

還包括熒光探針。

進一步的，所述抗體-寡核苷酸探針包括寡核苷酸探針部分和抗體部分；所述寡核苷酸探針部分是將寡核苷酸的5'端進行醛基修飾后得到的，所述抗體部分是將抗體進行肼基修飾后得到的；所述寡核苷酸探針部分和所述抗體部分經過偶聯得到所述抗體-寡核苷酸探針。

更進一步的，所述寡核苷酸探針部分是將5’端帶有氨基修飾的寡核苷酸，用摩爾當量為5-20倍的SFB進行醛基修飾后得到的；所述抗體部分是將抗體用摩爾當量為10-50倍的SANH進行肼基修飾后得到的。

其中，上述的SFB是指4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亞胺酯；上述的SANH是指對-丙腙基吡啶甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯，CAS號為362522-50-7。

所述抗體-寡核苷酸探針是將摩爾比為(7-10):1的寡核苷酸探針部分和抗體部分，在室溫條件下反應4-24小時后得到的。

優選的，所述寡核苷酸的長度為16-22nt，5’端為6-14nt長度的引物識別序列，3’端用延伸引物進行延伸擴展。

進一步的，所述延伸引物的長度為50-80nt，它的3’端末端與寡核苷酸的3’端互補配對，5’端可以形成發卡結構，且中間序列與熒光探針的序列互補。延伸引物的序列優選為SEQ ID NO：14所示。

優選的，所述寡核苷酸的序列為SEQ ID NO：1-13中所示的任一個。

所述擴增引物中包括一對用于將抗體-寡核苷酸探針進行PCR擴增的正向、反向引物，所述正向引物的5’端與寡核苷酸互補。

優選的，所述循環腫瘤細胞為宮頸癌、乳腺癌或前列腺癌循環腫瘤細胞中的一種或多種。

發明原理

癌癥干細胞是一類具有干細胞性質的癌細胞，也就是具有自我更新、分化能力、高度增殖能力以及它們能在裸鼠形成腫瘤。癌癥干細胞內部復雜的機制能夠解釋癌癥耐藥性以及很多典型的腫瘤的行為。癌癥發生的細胞假說就是指有一小部分亞群的腫瘤細胞有干細胞的特質，有能力產生新的腫瘤。癌癥干細胞不僅能誘導原發腫瘤的形成，還是引起腫瘤化療和放射治療后復發的關鍵誘因。針對不同來源的腫瘤，腫瘤干細胞表面的生物標志物不盡相同。

CD133、CD24和CD44都是癌癥干細胞的細胞表面標識物。它們的表達不僅在癌癥細胞系中被發現，而且在宮頸癌、前列腺癌、頭頸癌、肝臟腫瘤、腦癌、乳腺癌、肺癌等癌癥患者的組織中均有發現。且多標志物抗體的聯合應用可有效提高檢測敏感性和特異性(Journal of the National Cancer Institute,2009,101(1):61-66)。

因此可以通過平行檢測這三種細胞表面標志物在血液中細胞表面的表達量高低來判斷癌癥病人血液中CTC的侵襲力。

本發明具有如下有益效果：

1.本發明所述的試劑盒通過將CD133、CD24和CD44作為CSC的標識物，進行平行檢測CTC中各抗原的含量，從而得到CTC中CSC的表達量，分析出CTC的侵襲力高低。