[發明專利]高產丁醇的大腸桿菌基因工程菌及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 201610204922.3
• 申請日: 2016-04-05
• 公開（公告）號: CN107287143A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 董紅軍;趙春華;張天瑞;朱華偉;林兆;張延平;李寅
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/16;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,白艷

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種高產丁醇的大腸桿菌基因工程菌及其構建方法與應用。

背景技術

能源與環境是當今社會關注的焦點。隨著化石能源的日漸枯竭和自然環境的污染，人類對可再生能源的需求越來越強烈。利用微生物轉化或發酵可再生資源高效生產可再生能源是今后的能源發展趨勢，這種通過生物法生產化學品的方式是可持續的且環境友好的。

丁醇是一種重要的化工品和原料，可直接用作有機溶劑，是合成多種酯類化合物的前體，廣泛應用于各種塑料和橡膠制品中。同時，丁醇也是優良的可替代汽油的生物燃料。它具有和汽油相當的熱值與辛烷值，可與汽油以任意比例混合；在運輸過程中，不易腐蝕管道；與乙醇相比，其蒸汽壓低，安全性高，因此是一種極具潛力的新型生物燃料。目前，丁醇的年市場需求大約在百萬噸級別。

丁醇可由生物合成是巴斯德于1861年首次發現的，1912年，魏茲曼(Weizmann)發現了一種梭菌Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)能夠將淀粉轉化為丙酮、丁醇及乙醇。之后，很多研究便集中于改造丙酮丁醇梭菌，以期得到可用于工業化生產丁醇的工程菌株。但是，丙酮丁醇梭菌是一種嚴格厭氧生長的革蘭氏陽性細菌，其遺傳操作系統復雜，不利于進行實驗室的研究和工業的生產。2008年，Shota Atsumi,James C.Liao等首先在大腸桿菌中實現了丁醇的合成(Atsumi S,Cann A F,Connor M R,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production.Metabolic engineering,2008,10(6):305-311.)，該研究組將丙酮丁醇梭菌體內的丁醇合成途徑轉移至大腸桿菌內，致使其可產生少量丁醇。隨后，該研究組對整條途徑進行了優化，將以NADH為還原力，催化可逆反應巴豆酰輔酶A生成丁酰輔酶A的丁酰輔酶A脫氫酶復合物(Bcd-EtfAB complex)替換為來自齒垢密螺旋體(Treponema denticola)的催化不可逆反應的反式烯酰輔酶A還原酶(Ter)；催化乙酰輔酶A生成乙酰乙酰輔酶A的酶，由乙酰乙酰輔酶A硫解酶(Thl)換為大腸桿菌中活性更強的乙酰輔酶A乙酰轉移酶(AtoB)，由此形成了NADH和乙酰輔酶A的驅動力，丁醇產量大幅度提高。

目前的丁醇生產菌株都是基于質粒表達基因，并且使用誘導型啟動子，所以不適用于大規模的工業化生產。適合大規模生產丁醇的工業菌株需要所有的基因操作在染色體水平進行以保持遺傳穩定性，不需要誘導劑，并且要有較高的產量和得率以降低分離成本和原料成本，這樣的菌株目前還未見報道。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種構建重組菌的方法。

本發明提供的重組菌，包括如下步驟：

1)抑制生產丁醇的出發菌基因組上pykA基因表達和/或活性，且提高所述出發菌基因組上fdh基因的表達和/或活性，得到目的菌A；

2)在氮源不豐富的M9培養基中馴化目的菌A，得到目的菌B；

3)抑制所述目的菌B基因組上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表達和/或活性，且提高所述目的菌B中ter基因和crt基因的表達和/或活性，得到重組菌。

上述方法中，所述抑制生產丁醇的出發菌基因組上pykA基因的表達和/或活性為敲除所述出發菌基因組上pykA基因；

所述提高所述出發菌基因組上fdh基因的表達和/或活性為增加所述出發菌基因組中fdh基因的拷貝數；

所述抑制目的菌B基因組上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表達和/或活性為敲除所述出發菌基因組上的yieP、stpA、yqeG和yagM基因全部或部分片段；

所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的表達和/或活性為增加目的菌B中ter基因和crt基因的拷貝數。

上述方法中，所述增加出發菌基因組中fdh基因的拷貝數為將fdh基因及其啟動子整合到所述出發菌基因組上；

所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的拷貝數為將ter基因及其RBS和crt基因及其RBS整合到所述目的菌B基因組上。

上述方法中，所述敲除或整合均采用基因組定點編輯或同源重組的方式進行；

所述基因組定點編輯具體為ZFN編輯、TALEN編輯或CRISPR/Cas9編輯；