[發(fā)明專利]高產(chǎn)丁醇的大腸桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610204922.3
• 申請日: 2016-04-05
• 公開（公告）號: CN107287143A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 董紅軍;趙春華;張?zhí)烊?/a>;朱華偉;林兆;張延平;李寅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/16;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11245
• 代理人: 關(guān)暢,白艷

1.一種構(gòu)建重組菌的方法，包括如下步驟：

1)抑制生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上pykA基因表達和/或活性，且提高所述出發(fā)菌基因組上fdh基因的表達和/或活性，得到目的菌A；

2)在氮源不豐富的M9培養(yǎng)基中馴化目的菌A，得到目的菌B；

3)抑制所述目的菌B基因組上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表達和/或活性，且提高所述目的菌B中ter基因和crt基因的表達和/或活性，得到重組菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

所述抑制生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上pykA基因的表達和/或活性為敲除所述出發(fā)菌基因組上pykA基因；

所述提高所述出發(fā)菌基因組上fdh基因的表達和/或活性為增加所述出發(fā)菌基因組中fdh基因的拷貝數(shù)；

所述抑制目的菌B基因組上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表達和/或活性為敲除所述出發(fā)菌基因組上的yieP、stpA、yqeG和yagM基因全部或部分片段；

所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的表達和/或活性為增加目的菌B中ter基因和crt基因的拷貝數(shù)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述增加出發(fā)菌基因組中fdh基因的拷貝數(shù)為將fdh基因及其啟動子整合到所述出發(fā)菌基因組上；

所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的拷貝數(shù)為將ter基因及其RBS和crt基因及其RBS整合到所述目的菌B基因組上。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述敲除或整合均采用基因組定點編輯或同源重組的方式進行；

所述基因組定點編輯具體為ZFN編輯、TALEN編輯或CRISPR/Cas9編輯；

所述同源重組具體為λ-red同源重組或sacB基因介導篩選的同源重組或整合質(zhì)粒介導的同源重組。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于：

所述敲除出發(fā)菌基因組上pykA基因為采用λ-red同源重組系統(tǒng)將所述出發(fā)菌基因組上的pykA基因替換為FRT；

所述FRT具體為序列14第59-106位；

所述將fdh基因及其啟動子整合到目的菌A基因組為采用整合質(zhì)粒將所述出發(fā)菌基因組上maeB基因替換為含有fdh及其啟動子的片段1，且將所述出發(fā)菌基因組上位于mdh基因位點的FRT替換為含有fdh及其啟動子的片段2；

所述含有fdh及其啟動子的片段1的核苷酸序列具體為序列23第941-2535位核苷酸；

所述含有fdh及其啟動子的片段2的核苷酸序列具體為序列24第931-2525位核苷酸；

所述敲除出發(fā)菌基因組上yieP、stpA、yqeG和yagM基因部分片段為采用CRISPR/Cas系統(tǒng)分別敲除yieP基因序列第70-619位核苷酸、stpA基因序列第74-373位核苷酸、yqeG基因序列第1-695位核苷酸、yagM基因序列第121-855位核苷酸；

所述采用CRISPR/Cas系統(tǒng)敲除yieP、stpA、yqeG、yagM基因的靶基因分別為yieP、stpA、yqeG、yagM基因；

所述采用CRISPR/Cas系統(tǒng)敲除yieP、stpA、yqeG、yagM基因的sgRNA的核苷酸序列分別為序列33、序列34、序列35、序列27；

所述將ter基因及其RBS整合到所述目的菌B基因組為采用CRISPR/Cas系統(tǒng)將含有ter基因及其RBS的片段替換所述目的菌B基因組上yciA基因；

所述含有ter基因及其RBS的片段的核苷酸序列為序列25；

所述采用CRISPR/Cas系統(tǒng)敲除yciA基因的靶基因為yciA基因；

所述采用CRISPR/Cas系統(tǒng)敲除yciA基因的sgRNA的核苷酸序列為序列28；

所述將crt基因及其RBS整合到目的菌B基因組為將所述含有crt基因及其RBS的片段采用CRISPR/Cas系統(tǒng)替換目的菌B基因組上poxB基因；

所述含有crt基因及其RBS的片段的核苷酸序列為序列26；

所述采用CRISPR/Cas系統(tǒng)敲除poxB基因的靶基因為poxB基因；

所述采用CRISPR/Cas系統(tǒng)敲除poxB基因的sgRNA的核苷酸序列為序列29。