[發(fā)明專利]一種表達(dá)脯氨酸氨肽酶的重組畢赤酵母及其構(gòu)建方法

在審

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• 申請日: 2016-04-01
• 公開（公告）號: CN105733973A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田亞平;楊宏宇;周楠迪
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N9/48;C12N15/57;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種表達(dá)脯氨酸氨肽酶的重組畢赤酵母及其構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)及基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

脯氨酸氨肽酶作為一種外切型蛋白酶，在食品、醫(yī)藥和化工等多種領(lǐng)域都有很重要的應(yīng)用?？捎糜谌コ鞍姿庖褐械目辔?、蛋白質(zhì)的深度水解、生物活性肽的制備及重組蛋白固定劑或蛋白序列測定所需的工具酶等，在食品、醫(yī)藥保健與化工行業(yè)應(yīng)用前景廣闊。

米曲霉是一種廣泛用于生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè)菌，其表達(dá)的脯氨酸氨肽酶具有良好的理化性質(zhì)。但由于其表達(dá)量低，蛋白穩(wěn)定性差，且純化步驟繁瑣，很難滿足市場需求。目前對脯氨酸氨肽酶的異源表達(dá)研究主要集中于大腸桿菌等原核宿主，盡管提高了重組蛋白的表達(dá)量，但又存在以下缺點(diǎn)：1)不易分泌表達(dá)、易形成包涵體；2)產(chǎn)內(nèi)毒素具有安全隱患，不適用于食品酶的生產(chǎn)；3)包含有目的基因的質(zhì)粒易丟失，生產(chǎn)中需要添加大量抗生素，破壞了生態(tài)環(huán)境。因此，構(gòu)建一株能高效穩(wěn)定表達(dá)、遺傳背景清晰且利于純化的氨肽酶重組菌具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一株重組表達(dá)脯氨酸氨肽酶的畢赤酵母工程菌。所述畢赤酵母工程菌是以畢赤酵母GS115為表達(dá)宿主，以pPIC9K為表達(dá)載體，表達(dá)了核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的脯氨酸氨肽酶基因。

所述SEQIDNO.2所示的脯氨酸氨肽酶基因，是對來自米曲霉的脯氨酸氨肽酶基因(SEQIDNO.1)進(jìn)行優(yōu)化后得到的。

本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建所述畢赤酵母工程菌的方法，主要包括以下步驟：

(1)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增SEQIDNO.2所示的目的基因；擴(kuò)增得到的氨肽酶基因編碼的氨肽酶的N-端含有組氨酸標(biāo)簽；

(2)將PCR產(chǎn)物連接到表達(dá)載體pPIC9K上，獲得重組質(zhì)粒；

(3)測序正確的重組載體用PmeI進(jìn)行單酶切，經(jīng)酶切線性化之后，同畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞混勻，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，篩選獲取重組畢赤酵母。

本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述畢赤酵母工程菌發(fā)酵生產(chǎn)脯氨酸氨肽酶的方法，主要包括以下步驟：

①挑取YPD平板上活化的菌落于25mLBMGY培養(yǎng)基中，30℃、230rpm培養(yǎng)20h；

②將培養(yǎng)液置于無菌離心管中離心收集沉淀，將沉淀重溶于25mLBMMY培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)168h，每隔24h向培養(yǎng)液中添加終濃度0.5％的甲醇進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)；

③將獲得的發(fā)酵液，離心收集上清，即為氨肽酶胞外粗酶液，菌體沉淀稀釋一定倍數(shù)后超聲破碎，破碎液離心后即得胞內(nèi)粗酶液。

本發(fā)明對氨肽酶基因進(jìn)行了優(yōu)化，并首次在畢赤酵母中成功表達(dá)了重組脯氨酸氨肽酶。相比表達(dá)未經(jīng)優(yōu)化的氨肽酶基因的重組畢赤酵母，胞外酶活提高到1.66倍，胞內(nèi)酶活提高到2.1倍。與該基因在原核宿主大腸桿菌中的胞內(nèi)表達(dá)不同，脯氨酸氨肽酶在重組畢赤酵母中得到了部分分泌表達(dá)，且經(jīng)過搖瓶初步優(yōu)化后發(fā)酵液上清中的酶活為5.6U/mL，胞內(nèi)酶活為61.26U/mL。本發(fā)明方法簡單有效，構(gòu)建的重組畢赤酵母能高效表達(dá)脯氨酸氨肽酶，且重組蛋白包含組氨酸標(biāo)簽，利于后期重組蛋白的純化以及為進(jìn)一步研究脯氨酸氨肽酶的特性、結(jié)構(gòu)等提供所需蛋白。

附圖說明

圖1脯氨酸氨肽酶(pap)重組子的PCR驗(yàn)證(M：Marker，1-5：目的基因)

圖2重組質(zhì)粒pPIC9K-pap的雙酶切驗(yàn)證。(M：Marker，1-3：pPIC9K-pap重組質(zhì)粒的雙酶切，P：pPIC9K質(zhì)粒)

圖3重組質(zhì)粒pPIC9K-pap結(jié)構(gòu)示意圖

圖4重組脯氨酸氨肽酶的SDS-PAGE分析(M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，1：P.pastorisGS115/pPIC9K-pap細(xì)胞沉淀破碎上清，2:目的蛋白)

圖5重組畢赤酵母的生長曲線

圖6誘導(dǎo)起始時(shí)間對脯氨酸氨肽酶產(chǎn)酶的影響

圖7甲醇濃度對酵母產(chǎn)脯氨酸氨肽酶的影響

具體實(shí)施方式

所用培養(yǎng)基：

LB(g/L)：胰蛋白胨10，酵母膏5，NaCl10，pH7.0；

YPD(g/L)：蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂20；

MD(g/L)：葡萄糖20，瓊脂20，YNB13.4，生物素0.4；

MM(g/L)：甲醇5mL/L，瓊脂20，YNB13.4，生物素0.4；