[發明專利]一種表達脯氨酸氨肽酶的重組畢赤酵母及其構建方法在審
| 申請號： | 201610202929.1 | 申請日： | 2016-04-01 |
| 公開（公告）號： | CN105733973A | 公開（公告）日： | 2016-07-06 |
| 發明（設計）人： | 田亞平;楊宏宇;周楠迪 | 申請（專利權）人： | 江南大學 |
| 主分類號： | C12N1/19 | 分類號： | C12N1/19;C12N15/81;C12N9/48;C12N15/57;C12R1/84 |
| 代理公司： | 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211 | 代理人： | 耿曉岳 |
| 地址： | 214122 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 表達 脯氨酸 氨肽酶 重組 酵母 及其 構建 方法 | ||
1.一株重組表達脯氨酸氨肽酶的畢赤酵母工程菌，其特征在于，所述畢赤酵母工程菌是以畢赤酵母GS115為表達宿主，以pPIC9K為表達載體，表達了核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的脯氨酸氨肽酶基因。
2.一種構建權利要求1所述畢赤酵母工程菌的方法，其特征在于，主要包括以下步驟：
(1)設計引物擴增SEQIDNO.2所示的目的基因；擴增得到的氨肽酶基因編碼的氨肽酶的N-端含有組氨酸標簽；
(2)將PCR產物連接到表達載體pPIC9K上，獲得重組質粒；
(3)測序正確的重組載體用PmeI進行單酶切，經酶切線性化之后，同畢赤酵母感受態細胞混勻，進行電擊轉化，篩選獲取重組畢赤酵母。
3.一種應用權利要求1所述畢赤酵母工程菌發酵生產脯氨酸氨肽酶的方法，其特征在于，主要包括以下步驟：
(1挑取YPD平板上活化的菌落于25mLBMGY培養基中，30℃、230rpm培養20h；
(2)將培養液置于無菌離心管中離心收集沉淀，將沉淀重溶于25mLBMMY培養基中30℃培養168h，每隔24h向培養液中添加終濃度0.5％的甲醇進行甲醇誘導；
(3)將獲得的發酵液，離心收集上清，即為氨肽酶胞外粗酶液，菌體沉淀稀釋一定倍數后超聲破碎，破碎液離心后即得胞內粗酶液。
4.一種脯氨酸氨肽酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
5.權利要求1所述畢赤酵母工程菌在脯氨酸氨肽酶生產中的應用。
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