[發明專利]一種鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體的制備方法

在審

• 申請號: 201610201397.X
• 申請日: 2016-04-01
• 公開（公告）號: CN105693854A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 魏思遠;趙光偉
• 申請（專利權）人: 重慶三杰眾鑫生物工程有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/02;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 鄭自群

技術領域

本發明涉及生物制藥領域，具體涉及一種鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體的制 備方法。

背景技術

2010年以來，國內部分地區鴨流行一種以臨床癥狀為腳麻痹、采食量下降、 拉黃綠色稀便、產蛋驟降和神經癥狀，剖檢癥狀為心肌壞死、肝臟萎縮、脾臟 腫大出血、腸道輕微出血和出血性卵巢炎等為特征的疾病，病原鑒定為鴨坦布 蘇病毒(臨床通稱為黃病毒)，屬于黃病毒科黃病毒屬蚊媒病毒類恩塔亞病毒群， 是單股正鏈RNA病毒。該病毒對各種品系的鴨均致病，雛鴨最早發病日齡為7 日齡、20～40日齡及產蛋期高發，該病用常規抗病毒及抗菌治療療效不佳，死 淘率5～15％，繼發細菌感染時死淘率更高，恢復采食量需15天以上，商品鴨、 產蛋鴨愈后發育不良及產蛋率恢復差，該病目前無疫苗用于預防，對鴨養殖業 造成巨大經濟損失。

發明內容

針對以上現有技術的不足，提供一種安全性好，治療鴨坦布蘇病毒病效果 顯著的鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體的制備方法。

本發明還提供了所述鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體在治療鴨坦布蘇病毒病方 面的應用。

實現本發明的技術方案為：一種鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體的制備方法， 包括如下步驟：

(1)抗原制備：鴨坦布蘇病毒用生理鹽水10000倍稀釋，經尿囊腔接種11 日齡易感鴨胚，收集接種48～120小時死亡鴨胚尿囊液，無菌檢驗合格，即為 抗原；

(2)鴨坦布蘇病毒轉移因子-白細胞介素2佐劑滅活疫苗的制備：抗原加終 濃度為0.1％甲醛，37℃滅活24小時，期間振搖；于4℃離心30分鐘；收集上 清液，將所述上清液濃縮15倍，然后將濃縮液轉入滅菌容器，于4℃保存；往 濃縮抗原中加入轉移因子和鴨白細胞介素2，使轉移因子(按多肽計算)終濃度 為2mg/ml，鴨白細胞介素2終濃度為4μg/ml，即為鴨坦布蘇病毒轉移因子-白 細胞介素2佐劑滅活疫苗；

(3)高免雞蛋的生產：選擇健康的產蛋雞，用步驟(2)中所述鴨坦布蘇 病毒轉移因子-白細胞介素2佐劑滅活疫苗對雞群進行產蛋前免疫，當鴨坦布蘇 病毒卵黃中和抗體效價應≥1:640為合格，然后收集高免雞蛋；

(4)消毒：將所述高免雞蛋浸入40℃、0.1％新潔爾滅水溶液中消毒15～ 20分鐘，然后再將所述高免雞蛋用福爾馬林密閉熏蒸消毒30分鐘；

(5)分離卵黃：除去蛋清、胚盤和系帶、收集卵黃；

(6)抗體萃取：攪拌使卵黃呈均勻膏狀，裝入攪拌罐中，按體積比1:1加 入25℃的滅菌注射用水，調節pH至4.3；于轉速為200轉/分鐘，攪拌30分鐘；

將卵黃液轉入不銹鋼桶中，加入終濃度為4％正辛酸，攪拌30分鐘，室溫 放置12～24小時；用40目濾網撇去漂浮在上層的蛋黃，用80目濾布過濾，收 集濾液，濾出液和下層液體合并，用板框過濾器加濾板和0.4微米濾膜過濾，即 為抗體半成品；

將抗體半成品轉入用0.2％甲醛溶液消毒的冰柜中，4℃冷藏5小時，使殘留 的辛酸結晶凝結析出，用80目濾網撇去浮在上層的辛酸結晶，液調pH至7.0， 再后用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液調節pH至6.9，即為抗體半成品；

(7)過濾：抗體半成品用過濾精度0.2μm的筒式濾芯過濾除菌，無菌操 作分裝，即得到鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體。

優選地，所述步驟(7)中鴨坦布蘇病毒卵黃中和抗體效價≥1:512。

優選地，所述步驟(1)中，鴨胚接種為0.1ml/胚。

優選地，所述步驟(2)中振搖次數為4次，每次3分鐘。

作為優選，所述步驟(2)中離心轉速為4000轉/分鐘。

優選地，所述步驟(2)中濃縮是用截留分子量為6000道爾頓的中空纖維 超濾器。

優選地，所述步驟(3)的免疫程序如下：接種100～110日齡商品蛋雞， 依次進行：

基礎免疫：每只雞腿部肌肉注射0.5ml；

加強免疫：在基礎免疫后21日進行第2次接種，每只雞胸部肌肉注射1.5ml；

強化免疫：在加強免疫后15日進行第3次接種，每只雞頸背部皮下注射 2.0ml；

維持免疫：當卵黃中鴨坦布蘇病毒卵黃中和抗體效價臨界1:640時，維持接 種1次，每只雞頸背部皮下注射疫苗2.0ml。

本發明還提供了所述鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體在治療鴨坦布蘇病毒病方 面的應用。