[發(fā)明專利]一種免疫增強型CAPRI細(xì)胞制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610198644.5
• 申請日: 2016-04-01
• 公開（公告）號: CN105779390A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王盛;齊湘杰
• 申請（專利權(quán)）人: 王盛
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/078
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種免疫增強型CAPRI細(xì)胞制備方法，具體步驟包括：(1)獲取與受試者同血型的臍 帶血，分離并純化臍帶血單個核細(xì)胞(PBMC)；(2)獲取受試者外周血，分離并純化外周血單 個核細(xì)胞(PBMC)；(3)臍帶血血清制備；(4)受試者外周血單個核細(xì)胞和臍帶血單個核細(xì)胞 鏈?zhǔn)郊せ罟才囵B(yǎng)；(5)CAPRI細(xì)胞擴大增殖；(6)CAPRI細(xì)胞分次收獲。

2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述臍帶血PBMC的分離純化步驟為：采 集臍帶血約100ml左右，分裝至兩支50ml離心管中，2000-2500rpm離心20-30min，收集上 清血漿約60ml，并在每支離心管中分別加入20-35ml生理鹽水，小心混勻，沿管壁緩慢分裝 到預(yù)先加有6-8ml密度為1.075±0.001g/mlFicoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液的15ml離 心管中，2000-2500rpm離心20min后，用巴氏吸管吸取從上向下第二層富含造血干細(xì)胞層， 然后繼續(xù)用生理鹽水1800-2000rpm離心5-10min洗滌兩次，棄去上清，即獲得臍帶血單個 核細(xì)胞。

3.如權(quán)利要求1-2任一項所述的制備方法，其特征在于：所述從受試者外周血分離并純 化PBMC的步驟為：抽取受試者外周血50-100ml，加入終濃度為1.5×10⁵U/L的肝素鈉抗凝 處理，并將外周血分裝至兩支50ml離心管中，2000-2500rpm離心20-30min，棄上清，并在每 支離心管中分別加入10-25ml生理鹽水，小心混勻，沿管壁緩慢分裝到預(yù)先加有6-8ml密度 為1.077±0.001g/mlFicoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液的15ml離心管中，2000-2500rpm 離心20min后，用巴氏吸管吸取從上向下第二層單個核細(xì)胞層，然后繼續(xù)用生理鹽水1600- 1800rpm離心5-10min洗滌兩次，棄去上清，即獲得PBMC。

4.如權(quán)利要求1-3任一項所述的制備方法，其特征在于：所述臍帶血血清制備步驟為： 將從臍帶血分離的血漿分裝兩支50ml離心管中，2000-2500rpm離心20-30min，取上清，棄底 部紅細(xì)胞和血小板，56℃水浴30min滅活補體，2000-2500rpm/min離心20-30min，上清即為 所需的血清。

5.如權(quán)利要求1-4任一項所述的制備方法，其特征在于：所述受試者外周血單個核細(xì)胞 和臍帶血單個核細(xì)胞鏈?zhǔn)郊せ罟才囵B(yǎng)步驟為：將抗CD3單克隆抗體和RetroNectin包被于 75cm²的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，4℃過夜處理并在培養(yǎng)PBMC前用PBS緩沖液沖洗1次，再用無血清培 養(yǎng)基沖洗1次，然后取受試者外周血PBMC，使其重懸于24ml無血清細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640中， 混勻分裝到2個預(yù)先包被抗CD3單克隆抗體的75cm²培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%濃度CO₂培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)，2.5-3.5h后加入濃度為800-1200U/ml重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)、800-1200U/ml 重組人干擾素-γ(rhIFN-γ)、150-300U/ml重組人白細(xì)胞介素-18(rhIL-18)，繼續(xù)培養(yǎng) 2.5-3.5小時后，將臍帶血來源的PBMC用無血清培養(yǎng)基24ml重懸，混勻后平均加到以上2個 培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)48小時。

6.如權(quán)利要求1-5任一項所述的制備方法，其特征在于：所述用于包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶的 PBS緩沖液中抗CD3單克隆抗體的濃度為1μg/ml，RetroNectin的濃度為12.5ug/ml。