[發(fā)明專利]一種免疫增強(qiáng)型CAPRI細(xì)胞制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610198644.5
• 申請(qǐng)日: 2016-04-01
• 公開（公告）號(hào): CN105779390A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王盛;齊湘杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王盛
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783;C12N5/078
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種臍帶血單個(gè)核細(xì)胞參與的免疫增強(qiáng)型 CAPRI細(xì)胞制備方法。

背景技術(shù)

CAPRI細(xì)胞又名鏈?zhǔn)紺IK細(xì)胞，是單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子，如抗CD3單克 隆抗體、IL-2和IFN-γ等共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。CAPRI細(xì)胞具有安全有 效、殺瘤譜廣、副作用小等傳統(tǒng)生物治療的特點(diǎn)外，還具有典型的個(gè)體化免疫治療模式的特 點(diǎn)，其實(shí)施目的在于在手術(shù)、放化療等傳統(tǒng)治療的基礎(chǔ)上，控制病情（腫瘤停止發(fā)展、瘤體縮 小、甚至消失）、延長(zhǎng)生存時(shí)間、防止復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、消除微小殘余瘤灶和轉(zhuǎn)移灶、提高生活質(zhì) 量（改善食欲、睡眠、恢復(fù)體重、免疫功能增強(qiáng)、生理機(jī)能提高）等。CAPRI細(xì)胞已經(jīng)成為了新 一代腫瘤治療中的主要效應(yīng)細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐。CAPRI細(xì)胞治療原則上在化療開始 前就應(yīng)該規(guī)劃，最好在手術(shù)后、化療或放療開始前采集患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），如條 件允許也可在化療間隙期采集PBMC，由于采集PBMC后骨髓的再造旺盛，不宜馬上進(jìn)行化療 或放療以免骨髓損傷，在采集PBMC后至少間隔1周才能開始放化療。收獲CAPRI細(xì)胞時(shí)應(yīng)盡 量避免化療給藥當(dāng)天，最好能在給藥后16-24小時(shí)收獲細(xì)胞。在無法避開化療給藥的情況 下，可在化療給藥4小時(shí)后收獲細(xì)胞。

鑒于CAPRI細(xì)胞在腫瘤免疫治療上的顯著療效，從腫瘤患者外周血分離自體PBMC 進(jìn)行鏈?zhǔn)郊せ詈蛿U(kuò)大培養(yǎng)的方法已十分成熟，較為經(jīng)典的方法是德國(guó)申請(qǐng)WO02/087612A中 公開的級(jí)聯(lián)引發(fā)刺激過程：起始的CD3激活階段，將PBMC懸浮于培養(yǎng)基中，加入10%的 HyClone胎牛血清，并且沉積到固定化的抗CD3單克隆抗體上；IL2輔助階段，在2-4小時(shí)CD3 激活之后，加入IL-2，輔助激活并防止凋亡；引發(fā)階段，在2-3小時(shí)的IL-2輔助之后，將APC充 分活化用于引發(fā)初始PBMC；擴(kuò)充階段，將經(jīng)引發(fā)的PBMC技術(shù)，重新懸浮在具有IL-2的補(bǔ)充培 養(yǎng)基中；72小時(shí)擴(kuò)充后收獲CAPRI細(xì)胞。然而，上述方法中獲取PBMC時(shí)對(duì)患者身體狀況具有 嚴(yán)格的要求，在①患者白細(xì)胞＜4000個(gè)/ml、②化療后不到6周、③停止升白藥物后不到2周、 ④患者體質(zhì)差不能承受血細(xì)胞分離機(jī)采集單個(gè)核細(xì)胞過程、⑤其他不符合血細(xì)胞分離機(jī)采 集單個(gè)核細(xì)胞的情況下，PBMC的采集無法實(shí)現(xiàn)；在本申請(qǐng)人之前的專利申請(qǐng) ZL201410232692.0中公布了一種半合子CAPRI細(xì)胞制備方法，其采用獲取患者和半合子供 體外周血，分離、純化外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)；從半合子供體血漿制備血清；PBMC激活； CAPRI細(xì)胞擴(kuò)增；CAPRI細(xì)胞收獲；CAPRI細(xì)胞凍存的制備方式，通過增加前期細(xì)胞處理步驟 以及雙抗體裝載方法，獲得了細(xì)胞產(chǎn)量高且具有廣譜殺瘤作用的CAPRI細(xì)胞。該半合子 CAPRI細(xì)胞制備方法有效解決現(xiàn)有技術(shù)中由于患者自身狀況較差等因素導(dǎo)致的CAPRI細(xì)胞 培養(yǎng)無法進(jìn)行的問題。然而，在上述制備步驟中，如果尋找不到合適的半合子單個(gè)核細(xì)胞供 體，培養(yǎng)CAPRI細(xì)胞足量的PBMC無法采集；再者此方法中制備獲得的CAPRI細(xì)胞需要凍存，而 冷凍復(fù)蘇操作必然存在對(duì)CAPRI細(xì)胞活性損傷、并相應(yīng)地增加了儀器設(shè)備的投入。

已有研究表明，臍帶血單個(gè)核細(xì)胞來源的CAPRI細(xì)胞與自體單個(gè)核細(xì)胞來源的 CAPRI細(xì)胞相比，具有更高的體外擴(kuò)增能力和殺傷活性，而且臍帶血細(xì)胞具有來源廣泛、免 疫性低，潛伏性病毒和病原微生物的感染及傳播概率較低的特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)學(xué)者王小燕等(臍帶 血CIK細(xì)胞表型變化與細(xì)胞毒活性相關(guān)性研究，腫瘤基礎(chǔ)與臨床)已經(jīng)成功的從臍帶血分離 單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞因子抗CD3單克隆抗體、IL-2和IFN-γ誘導(dǎo)，體外培養(yǎng)擴(kuò)增獲得了CIK細(xì) 胞，其對(duì)U251細(xì)胞、SiHa細(xì)胞和A549細(xì)胞均具有較強(qiáng)的殺傷作用。但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)臍帶血單 個(gè)核細(xì)胞來源的CAPRI細(xì)胞的殺瘤作用比較持續(xù)，而外周血單個(gè)核細(xì)胞來源的CAPRI細(xì)胞則 在初始具有較強(qiáng)的殺瘤作用，但后續(xù)作用減弱，因而，臍帶血單個(gè)核細(xì)胞來源的CAPRI細(xì)胞 具有首劑效應(yīng)不強(qiáng)的弱點(diǎn)。