[發(fā)明專利]一種鑒定煙草品種純度的分子生物學方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610197063.X
• 申請日: 2016-03-31
• 公開（公告）號: CN105734141A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡長春
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北省煙草科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 江蘇愛信律師事務(wù)所 32241
• 代理人: 唐小紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種植物品種純度的鑒定方法，特別涉及一種采用基因組測序與序列比較對煙草品種純度進行準確鑒定的分子生物學方法，屬于煙草分子生物學技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

品種純度（varietalpurity）是指一批種子中（或良種繁殖田塊中）個體與個體之間在特征、特性方面典型一致的程度，即本品種的種子數(shù)（株、穗數(shù)）占供檢本作物（種）樣品數(shù)的百分率。中華人民共和國煙草行業(yè)標準煙草種子檢驗規(guī)程（YC/T20-1994）規(guī)定了的純度要求，原種要求純度不低于99.9%，一級良種不低于99.5%，二級良種不低于99.0%。

種子的真實性和純度是評價種子質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標。煙草品種純度的下降將導(dǎo)致煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量的明顯降低，比如上部葉開片不佳、株型變化、有效葉數(shù)減少、節(jié)距縮短、品質(zhì)下降及病蟲害抗性降低等，嚴重影響煙葉產(chǎn)業(yè)和煙農(nóng)的經(jīng)濟效益，對煙葉生產(chǎn)安全構(gòu)成重大威脅。鑒于此，目前，生產(chǎn)上主要采取了以下五種有效措施提高純度：（1）防止機械混雜。（2）嚴格隔離措施，防止生物學混雜。（3）對原種進行提純，防止品種本身遺傳特性改變。（4）防止自然突變。（5）正確人工選擇。

目前，鑒定品種純度的方法主要以下四種：（1）種子形態(tài)鑒定法。主要根據(jù)種子的形態(tài)特征如大小、形狀、顏色、光澤、種皮紋路等鑒定。（2）幼苗形態(tài)鑒定法。主要根據(jù)幼苗的整體形態(tài)、外部構(gòu)造、根系、葉片出現(xiàn)數(shù)量（分單子葉和雙子葉）、子葉出土/留土類型、幼苗缺陷等評估種子純度。（3）田間小區(qū)種植鑒定法。根據(jù)嚴格設(shè)置的田間試驗和執(zhí)行一致的田間管理，找出不符合本品種典型性狀或具有顯著變異的植株，計算出純度。（4）分子標記鑒定法。利用常用分子標記如：RFLP、RAPD、AFLP、SRAP、SSR和InDel標記對一定數(shù)量樣本逐一進行檢測，統(tǒng)計存在于對照與待檢材料之間的分子標記多態(tài)性的樣本數(shù)量，計算出純度。其中，綜合標記開發(fā)費用與鑒定效果，SSR標記使用最為廣泛，比如發(fā)明專利“一種快速鑒定油葵新葵19號品種純度的試劑盒（CN104164513B）”、“一種基于EST-SSR標記的甜瓜雜交種種子純度鑒定的方法（CN104059992B）”、“一種基于EST-SSR標記的龍眼雜交后代純度鑒定方法（CN103627799B）”等均使用了SSR分子標記，也有使用其他標記鑒定品種純度的發(fā)明專利“分子標記技術(shù)在快速鑒定雜交稻種真?zhèn)魏图兌确矫娴膽?yīng)用（CN1110248C）”等。上面前三種純度鑒定方法屬于宏觀的表型鑒定，結(jié)果的準確性受人、季節(jié)、氣候等環(huán)境因素影響較大，第四種方法屬于微觀的內(nèi)在遺傳物質(zhì)鑒定，不受環(huán)境因素影響，準確性大大提高，但該方法也只能根據(jù)分子標記進行PCR擴增出來的DNA片段長度或有無多態(tài)性差異來判斷品種差異和純度高低，卻無法檢測出堿基作為遺傳物質(zhì)最小單位的差異，換言之，常常存在個別堿基差異的品種無法用上述分子標記檢測出來，因此，開發(fā)出能從堿基這個最小遺傳單位水平上鑒定品種純度的方法顯得非常必要。

2010年，中國煙草基因組計劃正式啟動，2013年底國家煙草基因研究中心獲得了煙草全基因組參考序列，這為本發(fā)明中煙草品種基因組重測序序列的拼接、組裝和比較提供了序列參考模板，大大節(jié)約了時間，降低了開發(fā)成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種鑒定煙草品種純度的新方法，具體為一種鑒定煙草品種純度的分子生物學方法，可從最小遺傳單位的堿基水平上鑒定煙草品種純度，較宏觀表型類和微觀類的分子標記鑒定方法更準確、更能反映本質(zhì)差異，大大提高煙草品種純度鑒定結(jié)果的精確性，可作為煙草品種純度鑒定的“終審結(jié)果”，不受環(huán)境條件影響，對保證煙葉生產(chǎn)用種安全、促進煙葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展、保障煙農(nóng)經(jīng)濟利益及解決煙草品種知識產(chǎn)權(quán)糾紛意義重大。

所述一種鑒定煙草品種純度的分子生物學方法，其特征在于具體步驟依次如下：

A、將對照與待檢煙草品種種子分別播種于已標識的營養(yǎng)缽中，置于光照培養(yǎng)架上培養(yǎng)，24小時內(nèi)輔助燈光設(shè)計為開燈8~10小時，關(guān)燈14~16小時，室內(nèi)溫度保持在25~28℃，根據(jù)營養(yǎng)缽中營養(yǎng)土干濕情況補充水分；

B、待煙苗長出7~10片真葉后，隨機選取數(shù)量相等的對照與待檢煙草品種煙苗，每株煙苗采集1~3片真葉，采用CTAB小樣法提取和純化基因組總DNA，將每份DNA濃度調(diào)至相同，一般為100~200ng/μl，對照煙草品種各煙苗DNA等量混合構(gòu)建成為對照DNA混合池，待檢煙草品種各煙苗DNA等量混合構(gòu)建成為待檢DNA混合池，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>