[發明專利]雙檢測線SAA免疫熒光層析定量檢測試劑及其制備方法

在審

• 申請號: 201610196332.0
• 申請日: 2016-03-31
• 公開（公告）號: CN105785038A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 湯永平;李之華;張曉麗;潘秀華;解巧麗
• 申請（專利權）人: 廣州市微米生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/558;G01N33/543;G01N33/533
• 代理公司: 廣州市越秀區海心聯合專利代理事務所(普通合伙) 44295
• 代理人: 王海曼

1.一種雙檢測線SAA免疫熒光層析定量檢測試劑，包括PVC底板1，所述的底板上銜接樣品墊2，結合墊3、包被膜4和吸收墊5，其特征在于，所述的結合墊上噴有抗SAA單克隆抗體1和雞IgY，所述的抗SAA單克隆抗體1和雞IgY被同一種熒光微球標記；所述的包被膜上設有檢測線T₁、檢測線T₂和質控C線，所述的檢測線T₁包被的是抗SAA單克隆抗體2，所述的檢測線T₂包被有抗原SAA蛋白，質控C線包被有羊抗雞IgY。

2.制備權利要求1所述的雙檢測線SAA免疫熒光層析定量檢測試劑的方法，是在PVC底板上依次銜接樣品墊，結合墊、包被膜和吸收墊，其特征在于:

A.所述的結合墊3的制備方法是：將耦聯熒光微球標記抗SAA抗體1與雞IgY熒光微球溶液按2:1的體積比混合均勻，用噴金劃膜儀噴至聚酯纖維素膜上，噴量為3-5μL/cm，放入37℃烘箱，干燥8小時；

B.所述的熒光微球標記抗SAA抗體1的制備步驟依次包括下述步驟：

1)制備熒光微球溶液

2)將抗SAA單克隆抗體1按100μg/1mL的量，加入到步驟1)熒光微球溶液中，混勻室溫條件下旋轉反應30min；

3)按10μg/1mL的量，向步驟2)中加入BSA，封閉未耦聯抗體的活化羧基位點，反應30-60min，反應完成后將熒光微球溶液過分子篩層析柱進行純化，用pH7.4，0.01MPBS為液洗脫，收集熒光微球洗脫液以4℃，16000rpm，30min離心，棄去上清，加入pH9.0濃度0.05MTris-HCl的復溶液后超聲混勻；

C.所述的熒光微球標記雞IgY抗體的制備步驟如下：

1)制備熒光微球溶液

2)將雞IgY抗體按100μg/1mL的量，加入到步驟1)熒光微球溶液中，混勻室溫條件下旋轉反應30min；

3)按10μg/1mL的量，向步驟2)中加入BSA，封閉未耦聯抗體的活化羧基位點，反應30-60min，反應完成后將熒光微球溶液過分子篩層析柱進行純化，用pH7.4，0.01MPBS為洗脫液，收集熒光微球洗脫液，以4℃，16000rpm，30min離心，棄去上清，加入pH9.0濃度0.05MTris-HCl的復溶液后超聲混勻；

D.所述的包被膜的制備方法如下：

1、包被

1)檢測T₁線：用0.01MPBS，pH7.4內含0.5％-3％的海藻糖，將抗SAA抗體2稀釋到1mg/mL進行包被，劃線濃度為1μL/cm，速度100mm/s；

2)檢測T₂線：用0.01MPBS，pH7.4內含0.5％-3％的海藻糖將SAA抗原稀釋到2.5mg/mL進行包被，劃線濃度為1μL/cm，速度100mm/s；

3)質控C線：用0.01M的PBS，pH7.4將羊抗雞IgY單克隆抗體稀釋到1mg/mL進行包被，劃線濃度為1μL/cm，速度100mm/s；

2、干燥

放入37℃烘箱，干燥8小時。

3.根據權利要求2所述的雙檢測線SAA免疫熒光層析定量檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述的樣品墊2的制備方法是：將樣品墊浸泡在樣品墊緩沖液中，30min之后取出，于室溫干燥16-18小時。

4.根據權利要求3所述的雙檢測線SAA免疫熒光層析定量檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述的樣品墊的緩沖液配方如下：將0.5wt％BSA、1wt％海藻糖、1wt％S9溶解于0.01M，pH7.4的PBS緩沖液中。

5.根據權利要求2所述的雙檢測線SAA免疫熒光層析定量檢測試劑的制備方法，其特征在于，步驟B)中所述的熒光微球溶液的制備方法是：用1ml0.1MPH6.0的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸加入0.3mg0.3μm時間分辨熒光微球；加入25μL10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液和30μL50mg/mlN-羥基琥珀酰亞胺，室溫反應30min；以4℃，16000rpm離心20min，棄上清除去未反應的EDC和NHS，加入1ml0.1MPH6.0的MES，超聲混勻，得到熒光微球溶液。