[發明專利]回輸臨床治療用人胎盤葉狀絨毛膜來源的間充質干細胞體外三維分離培養保存方法

在審

• 申請號: 201610194777.5
• 申請日: 2016-03-30
• 公開（公告）號: CN105713869A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發明（設計）人: 王凌儀;曹小麗;陳玲;陳拓;陳強;李小珍;張穎;沈境;李磊;周燕婷
• 申請（專利權）人: 王凌儀
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
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技術領域

本發明屬于生物干細胞技術，組織工程領域。涉及一種體外構建高模擬體內貼附環境分離篩選，hCDMSC的無血清培養、擴增、儲存技術。組織構建和細胞體外培養是再生醫學干細胞治療領域的至關重要的熱門科技領域。回輸臨床治療用細胞是一種前瞻性的醫療手段，本發明特征是采用人胎盤葉狀絨毛膜來源的間充質干細胞體外三維分離培養保存方法，獲取高純度的臨床治療用hCDMSC，采用細胞外基質(extracellularmatrix,ECM)理論指導設計開發一種從未公開的報道的，葉狀絨毛膜高擬體內細胞外基質，篩選貼附培養技術。該培養體系保持原始未分化干性細胞，獲取符合細胞協會(ISCT)標準的干細胞其活性與傳代能力極強，無血清多組合培養液梯度馴化培養理論，使得hCDMSC具備回輸治療應用的安全性穩定性保障，是臨床藥物設計開發醫療機構開展干細胞治療科技基礎，同時也是組織工程領域具備前景的種子干細胞。

背景技術

近年來，國際國內對干細胞再生醫學研究領域越來越重視，細胞治療再生醫學得到了前所未有推進，科研領域沐浴在時代的朝陽下得以蓬勃發展。尤其是間充質干細胞已經成為一種新的治療手段，廣泛應用修復受損或病變的組織器官，治療心、腦血管疾病、神經系統疾病、臨床骨修復、軟骨修復、骨髓再生、肌肉再生、脂肪形成、肌腱修復、基因治療、血管支持、角膜損傷、燒傷燙傷創面修復等多種疾病。經過體外培養擴增后的干細胞在組織工程再生和多種組織修復中展示出令科研工作者印象深刻的治療廣泛性潛能，這種潛能是科研領域毋庸置疑的發展方向。

間充質干細胞(MesenchymalStemCellsMSCs)是一類自我更新和多向分化的能力。來源于胚胎發育早期中胚層的一類多能干細胞。是一種非血源性的多功能干細胞，廣泛存在于人體不同組織中，如骨髓、脂肪、牙周膜及臍帶，胎盤組織等。近幾年來有學者發現其主要來源骨髓間充質干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSc)可以自體移植，避免了移植后的免疫排斥。骨髓間充質干細胞的體外擴增比較容易，而且具有跨系或跨胚層分化為不同組織來源細胞的潛能，所以在臨床已經應用于中樞神經系統、心血管及免疫系統等多系統疾病的治療，在癌癥和遺傳性疾病研究中也有涉及。BMSc可體外誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌母細胞、并在一定的條件下誘導可分化為神經細胞，而且可進行自體移植,避免免疫排斥，被認為是治療多種疾病的良好細胞來源。也有研究者發現在胎盤組織中也含有豐富的間充質干細胞，提示可以將其提取作為干細胞移植治療的備選細胞。胎盤間充質干細胞具有采集方便、易于體外培養、擴增和誘導等特性，被認為是干細胞研究的一種理想種子細胞。

骨髓間充質干細胞，在美國FDA已批準在心肌干細胞移植方面進入一期臨床試驗,國內也開展多個二期臨床試驗，這充分展示了MSCs的巨大應用前景。不過骨髓間充質干細胞在骨髓中的含量較少，而且隨著年齡的增加，在骨髓中的含量逐漸減少，其增殖分化能力也逐漸減弱；同時骨髓間充質干細胞的取材是有創侵入性操作，增加了捐獻者的痛苦和感染的機會，所以骨髓間充質干細胞的臨床應用受到了一定的限制；并且病患嚴重感染、骨髓惡性腫瘤隨著年齡的增長骨髓細胞數及增殖、分化能力均明顯下降等情況下,患者就無法順利獲得足量可用于治療的BMSCs,為此很有必要尋找新的MSCs來源。

足月胎盤是分娩的廢棄物，取材容易，對供者不造成損傷，無倫理問題，而且胎盤體積大，獲得干細胞相對較多，所以胎盤間充質干細胞更方便適用于臨床。有學者在葉狀絨毛膜組織成功分離培養出胎盤間充質干細胞，并觀察其生物學特性和抗凋亡細胞因子血管內皮細胞生長因子、胰島素樣生長因子、肝細胞生長因子的分泌水平，結果證實葉狀絨毛膜間充質干細胞的生物學特性與骨髓間充質干細胞相似，并能分泌血管內皮細胞生長因子、胰島素樣生長因子和肝細胞生長因子。已有研究證實胎盤間充質干細胞具有與骨髓間充質干細胞類似的功能和特性，兩者的多向分化潛能也類似。胎盤起源于胚胎發育期胚外中胚層，由間質、血管、滋養細胞組成，含有大量的間充質成分，也含大量的干細胞。葉狀絨毛膜含有MSCs,在胎兒出生后多作為廢物與一起被丟棄的葉狀絨毛膜也含有與骨髓間充質干細胞相似特性的細胞，葉狀絨毛膜組織中確含有這些前體細胞，可以極大程度上地解決了干細胞的來源問題。