[發(fā)明專利]回輸臨床治療用人胎盤葉狀絨毛膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞體外三維分離培養(yǎng)保存方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610194777.5
• 申請(qǐng)日: 2016-03-30
• 公開（公告）號(hào): CN105713869A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王凌儀;曹小麗;陳玲;陳拓;陳強(qiáng);李小珍;張穎;沈境;李磊;周燕婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王凌儀
• 主分類號(hào): C12N5/073
• 分類號(hào): C12N5/073;C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種臨床治療級(jí)細(xì)胞治療用人胎盤葉狀絨毛膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法，由以下步驟組成；(1)人胎盤葉狀絨毛膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液組合；(2)篩選用葉狀絨毛膜高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)制備；(3)應(yīng)用葉狀絨毛膜高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)與人胎盤葉狀絨毛膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液組合篩選培養(yǎng)人胎盤葉狀絨毛膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，以及人胎盤葉狀絨毛膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞長期凍融保存液制備。

2.一種利用權(quán)利要求1所述的人胎盤葉狀絨毛膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液組合包括：

配制培養(yǎng)液A：胎盤多肽注射液0.05ml/L、EGF5～25ng/ml、干細(xì)胞生長因子(SCF)2～11ng/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5～15μg/ml、維生素B40.5～1mg/L、維生素C1～4μg/ml、胰島素5～8μg/ml、青霉素50～100u/ml、鏈霉素100u/mL、氫化可的松0.4μg/ml、商用培養(yǎng)基-低糖DMEM/F12(3:1)定容到500ml。PH控制在7.2～7.4；

配制培養(yǎng)液B：胎盤多肽注射液0.1ml/L、人血清白蛋白(HSA)1～3g/L、人血纖粘蛋白(FN)1～5μg/L、人層粘連蛋白(LN)5～10μg/L、血小板衍生因子(PDGF)1～10mg/L、胎盤生長因子(rhPIGF)1～6mg/L、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)1～6μg/L、EGF5～10ng/ml、維生素B1～5mg/L、葉酸1～10ng/ml、維生素E0.05～1mg/L、維生素B40.5～1mg/L、黃體酮0.01～0.04μg/L、輔酶Q100.1～2mM/L、膽固醇1～10mg/L、牛磺酸0.1～0.4g/L、肝素鈉0.1～0.3g/L、腺苷10～15ng/ml、胰島素5～6μg/ml、青霉素100u/ml、鏈霉素100u/mL、商用培養(yǎng)基低糖DMEM與商用培養(yǎng)基F12(1：1)定容到500ml。PH控制在7.2～7.4；

配制培養(yǎng)液C:人胎盤組織液0.01～0.3ml/L、人血清白蛋白(HSA)0.1～6g/L、人血纖粘蛋白(FN)3～25μg/L、人層粘連蛋白(LN)10～60μg/L、重組人胰島素樣生長因子-1(IGF-1)1～4mg/L、血小板衍生因子(PDGF)10～20mg/L、胎盤生長因子(rhPIGF)6～10mg/L、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)6～10μg/L、重組人肝細(xì)胞生長因子(HGF)5～20mg/L、EGF、bFGF10～25mg/L、重組人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)15～40ng/ml、維生素B1～4mg/L、葉酸1～15ng/ml、黃體酮0.01～0.06μg/L、維生素E0.05～1.2mg/L、維生素C0.1～10mg/L、維生素B40.1～0.5mg/L、輔酶Q100.1～2mM/L、膽固醇1～10mg/L、牛磺酸0.1～0.4g/L、肝素鈉0.1～0.3g/L、還原性谷胱甘肽3～6μg/L、油酸0.5～7.5mg/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白6～20mg/L、腺苷10～25ng/ml、胰島素5～7mg/L、多聚賴氨酸4～6mg/L、青霉素100u/ml、鏈霉素100u/mL、商用培養(yǎng)基低糖DMEM與商用培養(yǎng)基F12(1：1)定容到500ml。PH控制在7.2～7.4。

3.一種利用權(quán)利要求1所述篩用葉狀絨毛膜高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)制備方法，包括其中所述的葉狀絨毛膜高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)；制備包括以下步驟：A)葉狀絨毛膜組織消毒處理；B)葉狀絨毛膜高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)脫細(xì)胞處理；C)將消毒或經(jīng)脫細(xì)胞處理的葉狀絨毛膜高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行低溫、脫水、輻照滅菌處理；其中所述步驟B)的脫細(xì)胞方法選自冷酶交聯(lián)劑法、酶－非離子表面活性劑－絡(luò)合劑聯(lián)合法、絡(luò)合劑加鹽-陰離子表面活性劑法或胰酶聯(lián)合EDTA交聯(lián)液法。