[發(fā)明專利]一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610194077.6
• 申請(qǐng)日: 2016-03-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105695635A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦毅斌;盧冰霞;段群棚;何穎;李斌;梁家幸;蘇乾蓮;周英寧;蔣冬福;盧敬專;趙武
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚;何承鑫

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種豬流行性腹瀉病毒的多 重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，具體為針對(duì)變異毒株、經(jīng)典毒株及弱毒疫苗株一步法三重RT-PCR的 檢測(cè)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬流行性腹瀉（porcineepidemicdiarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒 （porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，該病 的主要特征是急性水樣腹瀉、嘔吐和脫水死亡；各種年齡階段的豬只均易感，對(duì)1～2周齡哺 乳仔豬危害最為嚴(yán)重，發(fā)病死亡率可高達(dá)90%～100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的危害和經(jīng)濟(jì)損 失。20世紀(jì)70年代，英國(guó)和比利時(shí)各自率先報(bào)道了該病的發(fā)生，隨后該病在世界上多個(gè)主要 養(yǎng)豬國(guó)家相繼暴發(fā)和流行，近年來(lái)亞洲一些國(guó)家如泰國(guó)、韓國(guó)、越南和中國(guó)多次報(bào)道了PED。

PEDV是套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒亞科 （Coronavirinae）甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus）的成員，為有囊膜的單股正鏈RNA病 毒。PEDV基因組全長(zhǎng)約28Kb，包括5’端非編碼區(qū)、3’端非編碼區(qū)以及至少７個(gè)開(kāi)放閱讀框 （ORF1a,ORF1b,ORF2~6），分別編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核衣殼蛋白 （N）、小包膜蛋白（E）和非結(jié)構(gòu)蛋白（復(fù)制酶1a、1b、ORF3蛋白）。S蛋白為Ⅰ型跨膜蛋白，位于病 毒粒子的表面，它在誘導(dǎo)感染宿主中和抗體的產(chǎn)生、與特異性受體的結(jié)合及細(xì)胞膜融合方 面發(fā)揮著十分重要的作用。此外，冠狀病毒S基因的變異可以引起病毒組織嗜性的改變和病 毒毒力的變化。ORF3基因是PEDV的一個(gè)附屬基因，編碼一種離子通道蛋白，可調(diào)節(jié)病毒產(chǎn) 量，可能病毒的毒力有關(guān)。PEDV弱毒疫苗株的ORF3基因在245-294bp存在49或51個(gè)核苷酸的 缺失，是弱毒株重要的分子標(biāo)記。

2010年底開(kāi)始，PED在我國(guó)大范圍暴發(fā)流行，臨床上主要表現(xiàn)為高發(fā)病率和高死亡 率的哺乳仔豬腹瀉（病死率達(dá)80%～100%），造成了大量的哺乳仔豬死亡。當(dāng)前，我國(guó)流行 PEDV毒株主要存在兩種類型，即PEDV經(jīng)典毒株和PEDV變異毒株，并且以變異毒株為優(yōu)勢(shì)流 行毒株。PEDV基因組中變異最大的區(qū)域位于S基因，且大多數(shù)的變異都聚集在S基因的N端。 與早期流行的經(jīng)典毒株（PEDVCV777）相比，PEDV變異毒株的S基因在N端存在15個(gè)堿基的插 入和6個(gè)堿基的缺失，從而導(dǎo)致流行毒株Ｓ蛋白的抗原位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)和跨膜螺旋均有明 顯變化。此外，研究顯示在采集的臨床樣品中還存在與弱毒疫苗株高度同源的毒株。

當(dāng)前我國(guó)廣泛流行的PEDV以變異毒株為優(yōu)勢(shì)毒株、經(jīng)典毒株并存為特點(diǎn)，再加上 弱毒株的廣泛使用，使得臨床上的PEDV毒株錯(cuò)綜復(fù)雜。常規(guī)檢測(cè)病毒分離、免疫組化、免疫 熒光試驗(yàn)及常規(guī)RT-PCR等并不能區(qū)分PEDV毒株類型；基因測(cè)序是鑒定毒株類型的有效方 式，但該方法操作復(fù)雜、消耗時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用成本高。我國(guó)目前尚無(wú)鑒別診斷豬流行性腹瀉病 毒變異株、經(jīng)典毒株和弱毒疫苗株的多重RT-PCR方法。因此，有必要建立一種快速簡(jiǎn)便有效 的豬流行性腹瀉病毒變異株、經(jīng)典毒株和弱毒疫苗株的多重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法。

基于以上的研究和當(dāng)前的需求，本研究根據(jù)PEDV弱毒疫苗株ORF3基因缺失49個(gè)核 苷酸以及變異毒株S基因連續(xù)的核苷酸插入的特征，設(shè)計(jì)并合成了2對(duì)檢測(cè)豬流行性腹瀉 病毒的引物，采用多重RT-PCR方法擴(kuò)增ORF3基因和S基因片段，通過(guò)擴(kuò)增片段的數(shù)量和分子 量大小，判斷是豬流行性腹瀉病毒變異株、經(jīng)典毒株還是豬流行性腹瀉病毒弱毒疫苗株，從 而特異、敏感、快速簡(jiǎn)便、低成本、有效的鑒別診斷豬流行性腹瀉病毒的毒株類型。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的為建立豬流行性腹瀉病毒（PEDV）變異毒株、經(jīng)典毒株及弱毒疫苗株 快速鑒別檢測(cè)方法，降低成本，并能快速、有效的檢測(cè)出豬流行性腹瀉病毒的三種毒株，提 供一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的技術(shù)方案 為：

一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括以下引物序列：

ORF3-F5’-gcgcgttttgctgtcat-3’（SEQID1），

ORF3-R5’-gtcaccaccttctaaaatcac-3’（SEQID2）；