[發明專利]一種單寧酸為模板的介孔硅固定化胰蛋白酶的制備方法

有效

• 申請號: 201610191243.7
• 申請日: 2016-03-30
• 公開（公告）號: CN105734036B
• 公開（公告）日: 2018-11-09
• 發明（設計）人: 劉燕;劉方方;倪良;孟敏佳;鐘國星
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08;C12N11/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種單寧酸為模板的介孔硅固定化胰蛋白酶的制備方法，包括如下步驟：步驟1、外表面氨丙基三乙氧基硅烷修飾的以單寧酸為模板的介孔硅的制備；步驟2、單寧酸為模板的介孔硅固定化胰蛋白酶的制備。以單寧酸為模板分子合成介孔硅材料。單寧酸廉價環保，且尺寸較大，可以合成具有較大孔徑的介孔硅材料。只在介孔硅的外表面接枝APTES，通過靜電相互作用使得酶無法固定化于材料外表面，而只能固定化于介孔孔道內，提高了胰蛋白酶的利用效率，使胰蛋白酶可以重復使用。本發明得到的固定化胰蛋白酶活力高，活力回收率高達75.6％，連續操作5次，活力保持在82％以上。

技術領域

本發明涉及單寧酸為模板的介孔硅固定化胰蛋白酶，尤其涉及一種單寧酸為模板的介孔硅固定化胰蛋白酶的制備方法，屬于材料制備和生物工程技術領域。

背景技術

胰蛋白酶(Trypsin)是一種動物來源的球狀蛋白水解酶，其水溶性好，能選擇地水解賴氨酸或精氨酸羧基所構成的肽鏈。但游離狀的酶在實際應用中，熱穩定性低、pH適用范圍窄、易受外界條件干擾，使其有效活性，催化活性降低。于是，固定化酶技術應運而生。酶被固定化后，穩定性有很大提高，對環境的耐受性增強，易分離，可多次使用，在食品、化工、醫藥等領域有廣泛的應用。

載體材料在固定化酶過程中起到了關鍵的作用。它一般需要有大的比表面積，擴散阻力小，穩定性好且再使用性好。在各種不同的載體中，介孔硅納米粒子(MSNP)，由于其高比表面積、親水性和生物相容性好等特點，適宜作為固定化酶的載體材料。

許多研究人員使用表面活性劑作為模板劑制備MSNP。離子型表面活性劑，例如十六烷基三甲基溴化銨，自組裝成膠束，經過煅燒后形成硅材料的孔隙結構。介孔結構的形成主要是由于離子型表面活性劑和硅酸鹽物種之間的靜電相互作用。而非離子型表面活性劑，例如三嵌段共聚物，形成介孔硅材料的主要動力為表面活性劑與硅酸鹽物種之間的氫鍵作用。氟碳表面活性劑也可以用來合成介孔硅材料，具有高穩定性和新穎的結構。所有這些例子里，表面活性劑作為模板劑形成不互聯圓柱形有序孔結構。

也有許多研究者使用非表面活性劑模板制備MSNP，例如酒石酸，葡萄糖，麥芽糖，氧化硼等。制備出的MSNP尺寸大小可調且具有很好的單分散性。但由于這些模板分子的尺寸較小，MSNP的孔徑一般小于3nm，不適宜于固定大尺寸的酶。

單寧酸(Tannic Acid，TA)是五倍子酸中的含多酚羥基的葡萄糖聚合物，它是一種抗氧化劑，穩定劑，也可以作為有機配體。同時，它也可作為一種非表面活性劑模板合成介孔硅材料。TA的分子尺寸較大(2.2×1.8×1.2nm)，可以制備出孔徑較大的MSNP。用TA替代有毒的表面活性劑作為模板劑，廉價且環境友好。

酶固定化方法也會對固定化酶的性能有很大的影響。其中，物理吸附法，由于操作簡單，反應條件溫和，固定化成本低，有更高的商業潛力。當以介孔硅材料為載體時，酶會同時固定化于材料的介孔孔道內與材料外表面。但結合于材料外表面的酶與材料結合不牢固，容易脫落。為了解決這一問題，可以在介孔硅材料外表面進行適當的修飾，通過靜電相互作用使得酶無法固定化于表面，而只能固定化于介孔孔道內。

發明內容

本發明的目的在于提供一種單寧酸為模板的介孔硅固定化胰蛋白酶及其制備方法，由于外表面由APTES修飾，酶只能固化化于介孔孔道內，提高了胰蛋白酶的利用效率，使胰蛋白酶可以重復使用。

本發明采用單寧酸為模板分子，正硅酸四乙酯(TEOS)為前體分子，以無水無水乙醇為溶劑，以氨水為催化劑，反應一段時間形成納米粒子，然后加入氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)修飾納米粒子的外表面，用無水乙醇和水將單寧酸和APTES洗去，制成只在外表面APTES修飾的介孔硅。然后將介孔硅與胰蛋白胰溶液混合進行固定化，制得固定化胰蛋白酶。具體如下：

一種單寧酸為模板的介孔硅固定化胰蛋白酶的制備方法，包括如下步驟：