[發(fā)明專利]不同氨基酸結(jié)構(gòu)的重組人內(nèi)皮抑素蛋白及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610189012.2
• 申請(qǐng)日: 2016-03-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105646701B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐根興
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 徐根興
• 主分類號(hào): C07K14/78
• 分類號(hào): C07K14/78;C07K19/00;C12N15/12;C12N15/62;C12N15/70;C12N15/85;C12N15/81;C12N15/66;A61K38/39;A61K47/42;A61P35/00;C12R1/84
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

本發(fā)明公開(kāi)了不同氨基酸結(jié)構(gòu)的重組人內(nèi)皮抑素蛋白及其制備方法和應(yīng)用，重組人內(nèi)皮抑素蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重組人內(nèi)皮抑素蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明的兩種重組蛋白具有抑制堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)誘導(dǎo)下的血管內(nèi)皮細(xì)胞增值活性和抑制雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成的活性，而且更容易進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞和雞胚絨毛尿囊膜血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，蛋白穿膜效果和N端的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性都有顯著提高，并且具有直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，可以發(fā)揮更好的抑制新生血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的作用，能夠用于治療新生血管生成引起的各種疾病，包括實(shí)體腫瘤和糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及用基因工程方法制備具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性或抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的多種不同氨基酸結(jié)構(gòu)的重組人內(nèi)皮抑素蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

1997年，哈佛大學(xué)O’Reilly等發(fā)現(xiàn)小鼠血管內(nèi)皮瘤(EOMA)細(xì)胞系的培養(yǎng)液能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。通過(guò)分離純化得到一種新的蛋白質(zhì)，命名為鼠的Endostatin，后來(lái)翻譯成血管內(nèi)皮抑制素(簡(jiǎn)稱內(nèi)皮抑素)。1997年9月10日，徐根興等申請(qǐng)了人內(nèi)皮抑素的發(fā)明專利(Zl97107112.8),2001年1月10日獲得發(fā)明專利授權(quán)，這是內(nèi)皮抑素國(guó)際上最早獲得授權(quán)的專利之一。通過(guò)大腸桿菌表達(dá)了人內(nèi)皮抑素基因，是人膠原蛋白十八基因1503-2055表達(dá)的蛋白活性片段，184個(gè)氨基酸，分子量20KD。與小鼠內(nèi)皮抑素氨基酸序列有85.33％的同源性，目前已經(jīng)完成三期臨床研究。美國(guó)酵母表達(dá)的184個(gè)氨基酸的內(nèi)皮抑素國(guó)際上最早進(jìn)入臨床研究，1999年6月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)EntreMed臨床實(shí)驗(yàn)申請(qǐng)，I期臨床啟動(dòng)，目前停留在II期臨床研究中，主要原因在于抗體產(chǎn)生幾率高、適應(yīng)癥選擇和皮下注射單藥用藥方式等問(wèn)題。國(guó)際第一個(gè)批準(zhǔn)生產(chǎn)的內(nèi)皮抑素類似品種(恩度)是192氨基酸，在內(nèi)皮抑素的N端增加了Met Gly Gly Ser His His His His His(His)等9個(gè)氨基酸，和內(nèi)皮抑素的183個(gè)氨基酸聯(lián)合形成192個(gè)氨基酸的內(nèi)皮抑素蛋白，大腸桿菌表達(dá)。黎曉新等的專利(專利申請(qǐng)?zhí)?01410102963.2)涉及內(nèi)皮抑素突變體和聚乙二醇(PEG)修飾的內(nèi)皮抑素不同氨基酸結(jié)構(gòu)突變的內(nèi)皮抑素重組蛋白。劉興漢等的專利(專利申請(qǐng)?zhí)?00410013621.X)涉及改變內(nèi)皮抑素氨基酸結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)抗腫瘤活性。王風(fēng)山等的專利(專利申請(qǐng)?zhí)?01210149201.9)涉及人類免疫缺陷病毒反式激活轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Tat(Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg)和內(nèi)皮抑素一起形成的融合蛋白。姚文兵等的專利(專利申請(qǐng)?zhí)?00810025406.X)涉及含有非天然氨基酸的內(nèi)皮抑素突變體及其衍生物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供多種重組人內(nèi)皮抑素蛋白，它具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，但是氨基酸序列和結(jié)構(gòu)與已經(jīng)批準(zhǔn)專利或批準(zhǔn)臨床研究的內(nèi)皮抑素蛋白都不同。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供這兩種內(nèi)皮抑素蛋白的基因工程制備方法，其中分別包括了大腸桿菌原核表達(dá)、酵母表達(dá)和CHO真核表達(dá)三種不同基因工程表達(dá)形式。

本發(fā)明的又一目的在于提供上述重組人內(nèi)皮抑素蛋白的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種重組人內(nèi)皮抑素蛋白，該重組人內(nèi)皮抑素蛋白為重組人內(nèi)皮抑素蛋白1、重組人內(nèi)皮抑素蛋白2和重組人內(nèi)皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白中的任意一種，所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述重組人內(nèi)皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。

上述重組人內(nèi)皮抑素蛋白的編碼基因，該編碼基因具有下述核苷酸序列之一：