[發(fā)明專利]不同氨基酸結(jié)構(gòu)的重組人內(nèi)皮抑素蛋白及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610189012.2
• 申請日: 2016-03-29
• 公開（公告）號: CN105646701B
• 公開（公告）日: 2019-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐根興
• 申請（專利權(quán)）人: 徐根興
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C07K19/00;C12N15/12;C12N15/62;C12N15/70;C12N15/85;C12N15/81;C12N15/66;A61K38/39;A61K47/42;A61P35/00;C12R1/84
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

1.一種重組人內(nèi)皮抑素蛋白，其特征在于：該重組人內(nèi)皮抑素蛋白為重組人內(nèi)皮抑素蛋白1、重組人內(nèi)皮抑素蛋白2 和重組人內(nèi)皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白中的任意一種，所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的重組人內(nèi)皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.權(quán)利要求1所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白的編碼基因，其特征在于：該編碼基因具有下述核苷酸序列之一：

（1）序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，其中SEQID NO.3為編碼氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重組人內(nèi)皮抑素蛋白1的核苷酸序列，SEQID NO.4為編碼氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的重組人內(nèi)皮抑素蛋白2的核苷酸序列，SEQID NO.6為編碼氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的重組人內(nèi)皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白的核苷酸序列；

（2）編碼序列表中如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的核苷酸。

3.包含有權(quán)利要求2中所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因重組菌。

4.用于表達(dá)如權(quán)利要求1所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白的重組表達(dá)載體，其特征在于：

所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白1的重組表達(dá)載體采用以下步驟制備：以SEQ ID NO.7所示的內(nèi)皮抑素核苷酸序列為模板，以如SEQ ID NO.8所示的引物（1）和如SEQ ID NO.9所示的引物（2）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pET9c載體分別用NdeI和BamHI酶切并進(jìn)行連接得到重組質(zhì)粒pET9c-En1；

所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白2的重組表達(dá)載體采用以下步驟制備：以上述的重組質(zhì)粒pET9c-En1為模板，分別以如SEQ ID NO.10所示的引物（3）和如SEQ ID NO.12所示的引物（5），以如SEQ ID NO.11所示的引物（4）和如SEQ ID NO.12所示的引物（5），以如SEQ IDNO.13所示的引物（6）和如SEQ ID NO.14所示的引物（7）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1，在以獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1為模板，用如SEQ ID NO.10所示的引物（3）和如SEQ ID NO.9所示的引物（2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2和pET9c載體分別用NdeI和BamHI酶切并進(jìn)行連接得到重組質(zhì)粒pET9c-En2；

所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白1的重組表達(dá)載體和所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白2的重組表達(dá)載體采用以下步驟制備：分別以重組質(zhì)粒pET9c-En1和重組質(zhì)粒pET9c-En2為模板，以如SEQID NO.16所示的引物（9）和如SEQ ID NO.17所示的引物（10）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA3.1載體分別用HindIII和XhoI酶切并進(jìn)行連接分別得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-En1和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-En2；

所述重組人內(nèi)皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白的重組表達(dá)載體采用以下步驟制備：將如SEQ ID NO.6所示的重組人內(nèi)皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白編碼基因通過EcoRI和NotI的酶切位點(diǎn)連接到穿梭質(zhì)粒pPICZαA上得到重組人內(nèi)皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白的重組表達(dá)載體。