[發明專利]血清中DCD的Elisa檢測方法

在審

• 申請號: 201610187336.2
• 申請日: 2016-03-28
• 公開（公告）號: CN105652020A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 邱芳華;薛志鋒;梁東艷
• 申請（專利權）人: 廣州市中醫醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 秦維

技術領域

本發明涉及免疫學檢測方法，具體涉及血清中DCD的Elisa檢測方法。

背景技術

Dermcidin(DCD)第一次是從人體汗液中分離出來的一種天然活性肽，其 編碼基因dermcidin最初被認為在汗腺中特異性表達。DCD在汗腺中表達并分泌 至汗液中，具有抗菌活性。后來Porter等研究發現在前列腺癌細胞、乳腺癌細 胞、胰腺組織、肝細胞中都有dermcidin的表達，并同時證實它是一種潛在的致 癌因子。

隨著DCD出現在編碼公認的腫瘤存活因子和惡病質因子，它是癌癥病人身 上一種重要的潛在治療靶點。而目前通用的DCD的檢測方法存在抗干擾性差的 問題。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供血清中DCD的Elisa檢 測方法。

為解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下：

血清中DCD的Elisa檢測方法，包括以下步驟：

1)配制標準溶液：取標準樣品，加稀釋緩沖液配制一組梯度濃度的標準溶 液；

2)取樣：將DCD抗體預包被于孔板；分別取標準溶液和血清樣本加至板孔 后依次加入生物素標記抗體；取TMB顯色液加入板孔作為對照孔；孔板加上蓋， 反應；

3)加含HRP的親和素：加入洗滌液洗滌，將含HRP的親和素加入除對照 孔以外的板孔，反應；

4)顯色檢測：加入洗滌液洗滌，加入TMB顯色液，反應；加入TMB終止 液；酶標儀在450nm測定O.D.值；以濃度為橫坐標、以步驟1)的標準溶液的 O.D.值為縱坐標作標準曲線；

5)計算濃度：通過標準曲線計算血清樣本中DCD的濃度。

作為優選，DCD抗體的獲得方法如下：向成年小鼠或大鼠以0.1-0.5mL/kg b.w.的劑量皮下注射DCD進行免疫，第5天以同樣的劑量再次免疫，第15天收 集存活小鼠或大鼠的血清，凝膠電泳分離出DCD抗體。

作為優選，所述洗滌液為質量分數為10-20％的吐溫水溶液。

作為優選，步驟1)中，所述稀釋緩沖液為PBS緩沖液或Tris-HCl緩沖液。

作為優選，步驟2)中，血清樣本是經稀釋緩沖液稀釋1-100倍的血清樣本。

相比現有技術，本發明的有益效果在于：

本發明提供了血清中DCD的Elisa檢測方法，該檢測方法簡單易行，先采 用包被DCD抗體的孔板與DCD反應，再依次與生物素標記抗體、酶標抗體進 行反應，從而形成DCD抗體-DCD-生物素標記抗體-含HRP親和素的四元復合 物，從而可以避免干擾，檢測人和動物血液樣品中的DCD的含量，具有較高的 靈敏性和抗干擾性。

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細說明。

附圖說明

圖1為實施例1的標準曲線圖。

具體實施方式

以下具體實施方式中，如未特別說明，所采用的試劑均可通過市售途徑獲 得，或是通過常規的實驗手段可獲得。本中心募集了88名志愿者作為受試者。

其中DCD抗體采用以下方式獲得：

向成年小鼠或大鼠以0.1-0.5mL/kgb.w.的劑量皮下注射DCD凍干標準品的生 理鹽水溶液進行免疫，第5天以同樣的劑量再次免疫，第15天收集存活小鼠或 大鼠的血清，凝膠電泳分離出DCD抗體。

本發明提供血清中DCD的Elisa檢測方法，包括以下步驟：

1)配制標準溶液：取標準樣品，加稀釋緩沖液配制一組梯度濃度的標準溶 液；

2)取樣：將DCD抗體預包被于孔板；分別取標準溶液和血清樣本加至板孔 后依次加入生物素標記抗體；取TMB顯色液加入板孔作為對照孔；孔板加上蓋， 反應；

3)加含HRP的親和素：加入洗滌液洗滌，將含HRP的親和素加入除對照 孔以外的板孔，反應；

4)顯色檢測：加入洗滌液洗滌，加入TMB顯色液，反應；加入TMB終止 液；酶標儀在450nm測定O.D.值；以濃度為橫坐標、以步驟1)的標準溶液的 O.D.值為縱坐標作標準曲線；

5)計算濃度：通過標準曲線計算血清樣本中DCD的濃度。

實施例1：