[發明專利]人乳頭瘤病毒58E7蛋白表達純化方法及應用

在審

• 申請號: 201610186695.6
• 申請日: 2016-03-28
• 公開（公告）號: CN105646677A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 程浩;鄭俏麗;姜少杰;陳賢禎;朱江;金納
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K14/025
• 分類號: C07K14/025;C07K16/08;C12N15/37;C12N15/70;C12N15/79
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬生物技術領域，涉及病毒蛋白的誘導表達和抗體制備，具體涉及人乳頭瘤病毒58型E7蛋白原核表達及在制備多克隆抗體中的應用。

背景技術

宮頸癌是最常見的女性生殖系統腫瘤之一，我國宮頸癌發病率居世界第二位，且呈逐年升高和年輕化的趨勢，其中青年女性(≤30歲)中宮頸癌發病率以每年2％-3％的速度增長。研究證實，高危型人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV)的持續感染是宮頸癌及癌前病變發生的主要原因。HPV58屬于高危型HPV病毒中的一種常見亞型，在我國宮頸癌患者中，HPV58感染病例數占總HPV感染病例數的11.5％～28％，僅次于HPV16和HPV18，HPV-58E7蛋白的表達成功可為疫苗的研制提供技術支持，也可作為感染干預性研究提供理論方法。目前臨床上缺乏可靠的檢測方法，HPV-58E7蛋白抗體的發明可為HPV臨床檢測提供新的方法，同時為科學研究提供新的方法學基礎。

HPV58型是引起宮頸癌的主要原因之一，目前的檢測手段很有限，如PCR,容易造成假陽性，或假陰性。

發明內容

本發明的目的是提供一種人類乳頭瘤病毒HPV-58E7蛋白的表達、純化方法，通過以下步驟實現：

(1)HPV-58E7基因的調取及擴增：設計HPV-58E7的擴增引物，并從HPV-58陽性人宮頸上皮細胞中有效擴增出該基因，其中用于擴增用于原核表達的HPV-58E7序列的上游引物序列為SEQIDNO.1：5’-CCGGGATCCATGAGAGGAAACAACCCAACG-3’，劃線部分為BamHⅠ酶切位點，下游引物序列為SEQIDNO.2：5’-CCGGAATTCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’，劃線部分為EcoRⅠ酶切位點；

用于擴增真核表達的HPV-58E7序列的上游引物序列為SEQIDNO.3：5’-CCGGAATTCATGAGAGGAAACAACCCAACGC-3’，劃線部分為EcoRⅠ酶切位點，下游引物序列為SEQIDNO.4：5’-CCGGGATCCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’，劃線部分為BamHⅠ酶切位點；

(2)HPV-58E7基因原核及真核表達載體的構建：將步驟(1)中得到的這兩個含不同酶切位點的HPV-58E7基因序列按照先后順序插入到載體pGEX-4T2和pEGFP-C1中，獲得用于后續實驗的重組載體pGEX-4T2-(HPV-58E7)和pEGFP-C1-(HPV-58E7)；

(3)GST-(HPV-58E7)融合蛋白的原核表達：將步驟(2)中構建的重組載體pGEX-4T2-(HPV-58E7)轉入大腸埃希菌DH5α，待細菌OD值介于0.6-0.8之間，加IPTG至終濃度為0.2mM，并在26-28℃的誘導溫度下，誘導4-6h后收集細菌，在250-300W超聲功率下，超聲時間9秒，間歇時間9秒，總時長約3min以破碎細菌，收集上清；

(4)GST-(HPV-58E7)融合蛋白的純化及HPV-58E7蛋白的獲得：通過(3)步驟獲得的上清與Glutathione-Sepharose4B磁珠(GEhealthcare)結合，再用凝血酶(GEhealthcare)切除GST標簽，獲取HPV-58E7蛋白，PBS透析過夜獲得純化的HPV-58E7蛋白。

在設計蛋白表達載體時，選擇含GST標簽的pGEX-4T2，有利于蛋白表達的可溶性，且在蛋白純化后，可將GST標簽切除，使獲得的蛋白更接近天然HPV-58E7蛋白。在誘導蛋白表達時為避免形成不可溶的包涵體，采取了優化IPTG濃度，誘導時間，降低了誘導溫度等措施。

大腸埃希菌宿主DH5α、真核表達載體pEGFP-C1購于大連寶生物TaKaRa。原核表達載體pGEX-4T2從GEhealthcare公司購得。

本發明的另一個目的是提供人類乳頭瘤病毒HPV-58E7蛋白在制備多克隆抗體中的應用。本發明獲得的人類乳頭瘤病毒HPV-58E7蛋白，通過免疫動物獲得血清并經過純化獲得高特異性、高效價比的多克隆抗體。