[發明專利]人乳頭瘤病毒58E7蛋白表達純化方法及應用

在審

• 申請號: 201610186695.6
• 申請日: 2016-03-28
• 公開（公告）號: CN105646677A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 程浩;鄭俏麗;姜少杰;陳賢禎;朱江;金納
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K14/025
• 分類號: C07K14/025;C07K16/08;C12N15/37;C12N15/70;C12N15/79
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.人乳頭瘤病毒58E7蛋白表達純化方法，通過以下步驟實現：

(1)HPV-58E7基因的調取及擴增：設計HPV-58E7的擴增引物，并從HPV-58陽性人 宮頸上皮細胞中有效擴增出這個基因，其中用于擴增用于原核表達的HPV-58E7序列的上游 引物序列為SEQIDNO.1：5’-CCGGGATCCATGAGAGGAAACAACCCAACG-3’，劃線部分 為BamHⅠ酶切位點，下游引物序列為SEQIDNO.2：5’-CCGGAATTCTTATTGCTGTGCA CAGCTAGG-3’，劃線部分為EcoRⅠ酶切位點；

用于擴增用于真核表達的HPV-58E7序列的上游引物序列為SEQIDNO.3： 5’-CCGGAATTCATGAGAGGAAACAACCCAACGC-3’，劃線部分為EcoRⅠ酶切位點，下游 引物序列為SEQIDNO.4：5’-CCGGGATCCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’，劃線部分為 BamHⅠ酶切位點；

(2)HPV-58E7基因原核及真核表達載體的構建：將步驟(1)中得到的這兩個含不同酶 切位點的HPV-58E7基因序列按照先后順序插入到載體pGEX-4T2和pEGFP-C1中，獲得用 于后續實驗的重組載體pGEX-4T2-(HPV-58E7)和pEGFP-C1-(HPV-58E7)；

(3)GST-(HPV-58E7)融合蛋白的原核表達：將步驟(2)中構建的重組載體 pGEX-4T2-(HPV-58E7)轉入大腸埃希菌DH5α，待細菌OD值介于0.6-0.8之間，加IPTG至終 濃度為0.2mM，并在26-28℃的誘導溫度下，誘導4-6h后收集細菌，在250-300W超聲功率 下，超聲時間9秒，間歇時間9秒，總時長約3min以破碎細菌，收集上清；

(4)GST-(HPV-58E7)融合蛋白的純化及HPV-58E7蛋白的獲得：通過(3)步驟獲得的 上清與Glutathione-Sepharose4B磁珠結合，再用凝血酶切除GST標簽，獲取HPV-58E7蛋白， PBS透析過夜獲得純化的HPV-58E7蛋白。

2.根據權利要求1所述的人乳頭瘤病毒58E7蛋白表達純化方法，其特征在于，步驟(1)、 (2)、(3)中，大腸埃希菌宿主DH5α、真核表達載體pEGFP-C1購于大連寶生物TaKaRa，原核 表達載體pGEX-4T2從GEhealthcare公司購得。

3.根據權利要求1所述方法獲得的人乳頭瘤病毒58E7蛋白在制備多克隆抗體中的應用。