[發(fā)明專利]核酸靶序列捕獲測序文庫的制備方法

有效

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• 申請日: 2016-03-29
• 公開（公告）號: CN105734679B
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發(fā)明（設計）人: 施小龍;唐超;張海偉;李麗仙;輦偉奇
• 申請（專利權）人: 重慶市腫瘤研究所
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 重慶信航知識產權代理有限公司 50218
• 代理人: 穆祥維

本發(fā)明公開了核酸靶序列捕獲測序文庫的制備方法；a)根據(jù)目標靶序列設計并合成捕獲探針A和B溶液；b)在待測DNA或RNA樣品中加入探針A溶液，同時加入DNA聚合酶或逆轉錄酶、dNTP和含Mg2+的緩沖液,延伸探針A；c)再加入鏈霉親合素包被的磁珠與探針A結合并洗滌磁珠；d)在含有磁珠的緩沖液中再添加探針B溶液；e)在緩沖液中加入DNA聚合酶、dNTP和含Mg2+的緩沖液延伸探針B；f)洗滌磁珠，通過加熱變性使捕獲探針B延伸產物從磁珠上解離洗脫下來；g)以捕獲探針B延伸產物為模板，用公共引物a和b進行文庫PCR擴增，本發(fā)明具有高通量、高特異性、高靈敏度、操作方便、操作成本低、適用范圍廣。

技術領域

本發(fā)明屬于核酸測定或檢驗方法的技術領域，具體是涉及一種基于引物延伸的核酸靶序列捕獲測序文庫的制備方法。

背景技術

近年來崛起的新一代高通量DNA測序技術能夠并行地對數(shù)十億的DNA片段進行序列測定以及量化，為基礎生物醫(yī)學研究和臨床檢測提供了一個強大的工具；高通量DNA測序技術的發(fā)展也帶動了另一項重要的技術的興起——靶序列捕獲測序；靶序列捕獲測序是首先通過一些靶向方法提取我們所關心目標基因的DNA片段制備成靶序列測序文庫，然后通過高通量測序對其進行分析，例如外顯子組(Exome)捕獲測序捕獲和測定占大約30Mb的全部外顯子序列；因為這種測序并不是該物種基因組的首次測序，故稱為靶向重測序(Targeted resequencing)；靶向測序技術對于龐大的人類或高等生物的基因組，可以成千上萬倍地提高測序的效率，極大地提高樣本的通量，使高通量測序更加有效地用于生物醫(yī)學領域；目前已經發(fā)展了多種靶序列捕獲策略，主要包括固相芯片捕獲、液相探針捕獲、分子倒置探針(Molecular inversion probes)以及乳液PCR(Raindance)等。

固相芯片捕獲方法是先將靶序列探針(50-70mer)用DNA芯片平行合成技術原位合成在玻璃片上，然后將制備好的測序文庫雜交到芯片上；經過條件嚴謹洗滌，所得到的捕獲產物經PCR擴增后測序；通常經過固相芯片捕獲，大概50％-60％的序列可以比對到靶序列區(qū)域。

液相捕獲方法是先用原位芯片或常規(guī)方法合成超長的靶探針(150-210mer)，然后將其通過T7RNA啟動子進行體外轉錄擴增，產生生物素化的RNA探針；該探針可以在試管中進行雜交和富集，相對固相捕獲要方便的多；目前這兩個方法已被廣泛地應用于連鎖分析或關聯(lián)分析所需的大樣本研究。

固相芯片捕獲和液相捕獲是目前最主要的靶序列測序文庫制備方法，但是它們在技術上仍然存在一定的局限性；首先，無論是固相芯片捕獲還是液相捕獲都需要首先將樣品DNA通過連接法制備成測序文庫，測序文庫制備的步驟繁瑣難以自動化、耗時耗力。測序文庫制備的步驟主要包括：將基因組DNA片段化，將片段化的DNA末端修補齊，在DNA聚合酶的作用下在3’末端加上一個腺苷酸，然后通過DNA連接酶在DNA片段的兩端連接含有通用引物序列的接頭序列，最后通過一對通用引物擴增DNA片段；然后將制備好的測序文庫和靶序列探針雜交，捕獲出靶序列。同時，由于測序文庫制備的步驟多并且每一步反應后都需要進行純化，測序文庫的制備依賴于起始DNA的量，通常需要100ng以上。然而，目前的研究或診斷常常需要分析極少量的細胞甚至單個細胞或者游離DNA，例如分析循環(huán)腫瘤細胞和循環(huán)腫瘤DNA需要靈敏度更高的靶向測序文庫制備方法。

另外，靶序列的捕獲探針昂貴，雜交捕獲的效率有限(通常50％-60％的捕獲效率)；因此該方法的通量低、靈敏度受到一定程度的限制，對于需要高通量的大規(guī)模基因組計劃或診療測序來說不是最適宜的方法。

隨著基因高通量測序在生命醫(yī)藥領域中迅速發(fā)展，其高通量檢測的優(yōu)點被廣泛應用，但是目前仍然缺乏一種高通量、高靈敏度、高特異性、低成本的靶序列文庫制備方法。

發(fā)明內容