[發(fā)明專利]核酸靶序列捕獲測(cè)序文庫(kù)的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610185978.9
• 申請(qǐng)日: 2016-03-29
• 公開（公告）號(hào): CN105734679B
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 施小龍;唐超;張海偉;李麗仙;輦偉奇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶市腫瘤研究所
• 主分類號(hào): C40B50/06
• 分類號(hào): C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 重慶信航知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50218
• 代理人: 穆祥維

1.一種核酸靶序列捕獲測(cè)序文庫(kù)的制備方法，其特征在于：其步驟如下：

a)根據(jù)目標(biāo)靶序列設(shè)計(jì)并合成兩組捕獲探針A和B溶液；捕獲探針A溶液中捕獲探針A(1,2,3…n)的結(jié)構(gòu)從5’到3’端分別是：生物素標(biāo)記、公共序列P1和與靶序列一側(cè)互補(bǔ)的特異性捕獲引物序列a(1,2,3…n)；捕獲探針B溶液中捕獲探針B(1,2,3…n)的結(jié)構(gòu)從5’到3’端分別是：公共序列P2和與靶序列一側(cè)相同的特異性引物序列b(1,2,3…n)；

b)在待測(cè)的DNA或RNA樣品中首先加入捕獲探針A溶液，然后同時(shí)加入DNA延伸所需的DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP和含Mg²⁺的緩沖液，捕獲探針A通過其3’端的靶特異性序列a(1,2,3…n)和待測(cè)樣品中的互補(bǔ)DNA或RNA鏈雜交，并且探針的3’末端在DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以靶序列為模板進(jìn)行DNA合成，將靶序列復(fù)制到捕獲探針A上，形成有靶序列的捕獲探針A單鏈，捕獲探針A單鏈的結(jié)構(gòu)為：從5’到3’端分別是生物素標(biāo)記，公共序列P1，特異性引物序列，目標(biāo)靶序列；

c)再加入鏈霉親合素包被的磁珠，捕獲探針A通過其5’末端的生物素標(biāo)記結(jié)合到鏈霉親合素包被的磁珠上，然后分離磁珠，將反應(yīng)液去除，洗滌磁珠，去除非特異性吸附；將結(jié)合有捕獲探針A延伸產(chǎn)物的磁珠重新懸浮在緩沖液中；

d)在含有磁珠的緩沖液中再添加捕獲探針B溶液，捕獲探針B通過其3’末端的靶特異性序列與捕獲探針A上復(fù)制的目標(biāo)靶序列單鏈互補(bǔ)區(qū)域雜交，然后洗滌磁珠去除非特異性吸附，將磁珠重新懸浮在緩沖液中；

E)在緩沖液中加入DNA聚合酶、dNTP和含Mg²⁺的緩沖液，雜交的捕獲探針B的3’末端以捕獲探針A延伸產(chǎn)物為模板進(jìn)行DNA合成，捕獲探針B延伸產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)為：公共引物序列P2-B組特異性引物序列-目標(biāo)靶序列-A組特異性引物序列-公共序列P1；

F)洗滌磁珠，通過加熱變性使捕獲探針B延伸產(chǎn)物從磁珠上解離洗脫下來(lái)；收集捕獲探針B延伸產(chǎn)物；

G)以捕獲探針B延伸產(chǎn)物為模板，用公共引物a和b進(jìn)行文庫(kù)PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物即為靶序列捕獲測(cè)序文庫(kù)；

所述DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶包括各種DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，所述DNA聚合酶包括高保真DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和Klenow聚合酶，所述逆轉(zhuǎn)錄酶包括II反轉(zhuǎn)錄酶和ThermoScript^TM酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸靶序列捕獲測(cè)序文庫(kù)的制備方法，其特征在于:所述待測(cè)的DNA或RNA樣品設(shè)置為基因組DNA、線粒體DNA、游離DNA、cDNA、總RNA、信使RNA、長(zhǎng)非編碼RNA、小RNA和RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸靶序列捕獲測(cè)序文庫(kù)的制備方法，其特征在于：針對(duì)所有目標(biāo)靶序列設(shè)計(jì)并合成兩組捕獲探針A和B溶液對(duì)應(yīng)的目標(biāo)靶序列數(shù)目設(shè)置為不少于1個(gè)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸靶序列捕獲測(cè)序文庫(kù)的制備方法，其特征在于：1個(gè)所述捕獲探針A可以對(duì)應(yīng)設(shè)置有不少于1個(gè)捕獲探針B或者1個(gè)所述捕獲探針B可以對(duì)應(yīng)設(shè)置有不少于1個(gè)捕獲探針A。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸靶序列捕獲測(cè)序文庫(kù)的制備方法，其特征在于：所述探針A和探針B上的公共引物區(qū)域和特異性引物區(qū)域都可以設(shè)置有簡(jiǎn)并性堿基。