[發(fā)明專利]一種多肽化衍生方法及其在MALDI?TOF?MS檢測(cè)小分子化合物中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610185724.7
• 申請(qǐng)日: 2016-03-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105699476B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮鈺锜;袁必鋒;唐峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/64
• 分類號(hào): G01N27/64
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙)42222
• 代理人: 張火春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多肽衍生化結(jié)合MALDI-TOF-MS的方法及其在代謝組學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后，又一表征生命體系狀況的研究領(lǐng)域；生物體內(nèi)的代謝物的檢測(cè)對(duì)研究基因表達(dá)、探索生命過(guò)程、疾病診斷和預(yù)防等方面都具有深刻意義。因此，對(duì)代謝物的分析是分析化學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)重要的研究方向。

質(zhì)譜作為代謝組學(xué)研究的重要手段，具有靈敏度高、專一性好、定性能力強(qiáng)等顯著優(yōu)點(diǎn)。目前對(duì)小分子代謝物的最常用的質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)。雖然LC-ESI-MS的靈敏度較高，但是LC-MS的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不適用于快速高通量分析。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)由于其檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便、高通量等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于DNA、蛋白質(zhì)、多肽、多糖等大分子樣品的檢測(cè)?？紤]到MALDI-TOF-MS檢測(cè)的快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度、高通量等優(yōu)勢(shì)，我們嘗試將其拓展到對(duì)小分子代謝物的檢測(cè)。但是MALDI-TOF-MS雖然在檢測(cè)大分子物質(zhì)上具有顯著的優(yōu)越性，卻不適合檢測(cè)代謝物這種小分子物質(zhì)，主要是由于其通常所用的基質(zhì)CHCA、DHB、3-HPA、2,4,6-THP等在小分子(<500Da)區(qū)段會(huì)對(duì)目標(biāo)分析物有嚴(yán)重的基質(zhì)干擾。為克服這一缺點(diǎn)，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的方法主要分為兩類：1)采用基質(zhì)干擾小的基質(zhì)，比如多孔硅、納米微球、金屬氧化物、碳材料等，但依然沒(méi)有一種方便、廣泛適用的基質(zhì)被開(kāi)發(fā)出來(lái)；2)設(shè)計(jì)大分子衍生化試劑衍生小分子待測(cè)物，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的衍生化試劑的制備通常很繁瑣和一定局限性。因此，在小分子化合物的MALDI-TOF-MS分析中迫切需要發(fā)展一種簡(jiǎn)便的、高靈敏度、普適的衍生方法。

本發(fā)明針對(duì)上述問(wèn)題，首次開(kāi)發(fā)以多肽作為衍生化試劑來(lái)衍生小分子代謝物的新型MALDI-TOF-MS檢測(cè)手段，從而克服MALDI-TOF-MS在小分子物質(zhì)檢測(cè)方面的劣勢(shì)，開(kāi)拓MALDI-TOF-MS在代謝組學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。具有操作簡(jiǎn)便、快速、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于生物樣品的分析。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種能應(yīng)用于小分子代謝物檢測(cè)領(lǐng)域中，結(jié)合化學(xué)衍生化策略的具有高靈敏度和普適性的MALDI-TOF-MS分析方法。

本發(fā)明提供的衍生化技術(shù)和分析方案包括如下步驟：

(1)通過(guò)PM3方法對(duì)多肽進(jìn)行分子模擬和計(jì)算后，篩選到用于衍生化的多肽，該多肽含有在MALDI源中易電離的精氨酸、苯丙氨酸等基團(tuán)；

(2)用步驟(1)獲得的多肽衍生待測(cè)小分子物質(zhì)，使這些小分子帶上易電離的氨基酸殘基鏈。

本發(fā)明通過(guò)分子模擬篩選出高靈敏度的多肽作為衍生化試劑，用N端修飾半胱氨酸和馬來(lái)酰亞胺的多肽分別衍生醛類化合物和巰基類化合物，再用MALDI-TOF-MS檢測(cè)這些經(jīng)過(guò)多肽標(biāo)記的小分子代謝物。

一種衍生化方法：采用序列為CFRGLRGF的多肽P2(如SEQ NO.1所示)和序列為KFRGLRGF(Lys上修飾馬來(lái)酰亞胺)的多肽P7(如SEQ NO.2所示)分別作為醛類物質(zhì)和巰基類物質(zhì)的衍生化試劑，水作為反應(yīng)溶劑，磷酸緩沖溶液作為緩沖劑；

反應(yīng)條件為：醛類化合物/多肽P2(20～100，c/c)加入到pH為4～6的磷酸緩沖溶液中，25～37℃下衍生1～10h。巰基化合物/多肽P7(2～10，c/c)加入到pH為5～7的磷酸緩沖溶液中，4～37℃下衍生0.2～2h；

所述的衍生化反應(yīng)是指含有Cys的多肽與醛類化合物發(fā)生的脫水縮合反應(yīng)；Lys上修飾馬來(lái)酰亞胺的多肽與巰基類化合物發(fā)生的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。

優(yōu)選地，醛類化合物、多肽P2以摩爾比為50：1加入到pH為4的磷酸緩沖溶液中，25℃下，發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，5h。

優(yōu)選地，巰基類化合物、多肽P7以摩爾比為5：1加入到pH為6的磷酸緩沖溶液中，4℃下，發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，0.5h。

由于所述的多肽衍生化試劑帶有容易在MALDI-MS中結(jié)合質(zhì)子發(fā)生電離的氨基酸殘基，包括Arg(精氨酸),Phe(苯丙氨酸)等，發(fā)現(xiàn)篩選出的多肽具有較高的質(zhì)子親和勢(shì)，從而在質(zhì)譜中容易結(jié)合質(zhì)子，具有高靈敏度。