[發明專利]微囊化免疫細胞凍存與復蘇方法

在審

• 申請號: 201610184699.0
• 申請日: 2016-03-29
• 公開（公告）號: CN105746493A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 曾憲卓;曾明哲
• 申請（專利權）人: 深圳愛生再生醫學科技有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/0783
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種微囊化免疫細胞凍存與復蘇方法。

背景技術

細胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的全新的抗腫瘤治療方法，彌補了傳統的手術、放療、化療的弊端，已經被公認為二十一世紀腫瘤綜合治療模式中最活躍、最有發展前途的一種治療手段,也是世界目前唯一有希望完全消滅腫瘤細胞的治療手段。

免疫細胞是指參與免疫應答或與免疫應答相關的細胞，包括淋巴細胞、樹突狀細胞、單核/巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞等。免疫細胞可以分為多種，在人體中各種免疫細胞擔任著重要的角色。從血液中分離出來的單個核細胞包括：T細胞、B細胞、NK細胞和DC細胞等，是免疫細胞治療中的初始細胞來源，經各類細胞因子誘導擴增培養，得到一群具有高效殺傷活性的免疫細胞群。

常見的免疫細胞治療種類包括NK細胞、CIK細胞、DC-CIK細胞、TIL細胞、LAK細胞、CART細胞等。所有這些經誘導和擴增培養的免疫細胞的初始細胞來源都是外周血或臍血的單個核細胞，而且是直接分離培養。隨著年齡的增長，免疫細胞在體內的活性也會隨之降低，所以在年輕時期凍存具有較高活性的免疫細胞，對于未來罹患腫瘤相關疾病的治療可以起到很好的保障，因此免疫細胞凍存及凍存后的復蘇培養具有非常大的意義。除此之外，隨著免疫細胞治療項目的逐步推廣，免疫細胞的遠程運輸，長期保存問題就凸顯出來，也是細胞制備區域化進程中必須解決的問題。

目前，細胞凍存主要是采取-196℃超低溫條件下的保存方案，在超低溫條件下，細胞的代謝功能停滯，但并未死亡。而細胞復蘇則主要采用凍存細胞在37℃快速解凍的方法，以恢復細胞的活性和功能。但是現有的免疫細胞凍存方法適用于凍存干細胞和腫瘤細胞，對于免疫細胞，在凍存過程中則易形成冰晶損傷細胞，復蘇后細胞活率低、細胞增殖數量不足、細胞易老化，存在效率低下，凍存質量不高、細胞復蘇后活性差以及成活率不高等問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，針對現有技術中免疫細胞凍存方法存在凍存效率差，且免疫細胞復蘇成活率低等缺陷，提供一種能夠提高免疫細胞凍存效率并提高免疫細胞復蘇成活率的微囊化免疫細胞凍存方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：提供一種微囊化免疫細胞凍存方法，包括以下步驟：獲取免疫細胞；

將所述免疫細胞與用于制作微囊的囊材混合進行微囊化處理，獲得微囊化免疫細胞；

將所述微囊化細胞置于細胞凍存液中進行凍存。

在本發明提供的微囊化免疫細胞凍存方法中，所述囊材為殼聚糖或海藻酸-聚賴氨酸。

在本發明提供的微囊化免疫細胞凍存方法中，所述囊材為海藻酸-聚賴氨酸，且所述微囊化處理的過程包括以下步驟：

將所述免疫細胞和海藻酸溶液混合攪拌至免疫細胞濃度為(0.5～2)×10⁷個/ml，逐滴加入氯化鈣溶液中，形成凝膠球后，加入聚賴氨酸包埋。

在本發明提供的微囊化免疫細胞凍存方法中，所述聚賴氨酸包埋的時間為1～12分鐘。

在本發明提供的微囊化免疫細胞凍存方法中，所述聚賴氨酸包埋后，還包括采用有機酸溶液液化微囊的步驟。

在本發明提供的微囊化免疫細胞凍存方法中，所述細胞凍存液包括二甲基亞砜、人血清和AIM-V培養基。

在本發明提供的微囊化免疫細胞凍存方法中，；所述AIM-V培養基中，二甲基亞砜的體積分數為5～15％，人血清的體積分數為5～15％。

在本發明提供的微囊化免疫細胞凍存方法中，所述凍存過程，還包括以下步驟：

將置于所述細胞凍存液中的微囊化免疫細胞溫度降至-60～-100℃后，置于-170～-200℃溫度下凍存。

本發明進一步保護一種微囊化免疫細胞凍存后的復蘇方法，其特征在于，將權利要求1～8任一項所述的凍存后微囊化免疫細胞進行復蘇的過程，包括以下步驟：

將凍存后的微囊化免疫細胞以20～40℃/min的速度升溫至-100℃，然后置于含有體積分數為20％～40％二甲基亞砜的水溶液中迅速升溫至融化。

在本發明提供的微囊化免疫細胞凍存后的復蘇方法中，微囊化免疫細胞解凍之后，于室溫下將微囊化免疫細胞放入磷酸鹽緩沖液中稀釋，逐步透出二甲基亞砜，離心棄上清，洗滌，加入無血清培養基進行培養。