[發明專利]一種基于Northern雜交檢測家蠶microRNA的方法

在審

• 申請號: 201610184491.9
• 申請日: 2016-03-28
• 公開（公告）號: CN105695602A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 劉仕平;夏慶友
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 裴娜

技術領域

本申請屬于生物遺傳領域，具體地說，涉及一種基于Northern 雜交檢測家蠶microRNA的方法。

背景技術

印跡技術是將生物大分子從凝膠轉移到一種固定基質上的過 程，由Southern最先于1975年建立，用以研究DNA圖譜，也稱 作Southern雜交。之后，許多研究者應用Southern雜交技術開展 研究。1977年，Alwine等首次運用印跡技術檢測RNA，這種與 DNA印跡技術相對應的RNA印跡技術被稱為Northern印跡雜交 (Northernblot)。Northern雜交只需要利用一段單鏈cDNA分子 探針便可以檢測和測量不同長度的RNA分子，所以很快就得到 了廣泛運用。1993年，Lee等運用Northern雜交技術鑒定了第1 條miRNA，即線蟲(Caenorhabditiselegans)的lin-4；2000年， Reinhar等、Pasquinelli等利用Northern雜交技術在線蟲和果蠅 (Drosophilamelanogaster)中發現了第2條miRNA，即let-7。 2001年，有3個實驗室通過Northern雜交和克隆測序鑒定了線蟲、 果繩以及哺乳動物中的200多條miRNA，開啟了miRNA研究的 新時代。作者于2007年首先利用Northern雜交技術對家蠶miRNA let-7進行了鑒定和表達研究，隨后又利用該技術與miRNA芯片 對預測的90多條家蠶miRNAs進行了鑒定和時空表達譜分析。 Northern雜交曾被認為是miRNA鑒定的金標準。然而，由于 Northern雜交的過程長，操作步驟繁多，加之miRNA自身存在分 子短小和表達量低等特點，因此一些很重要的操作細節即可能直 接影響到實驗的成敗，要得到miRNA的高質量Northern雜交圖 并不容易。

發明內容

有鑒于此，本申請針對現有技術中存在Northern雜交的過程長， 操作步驟繁多的問題，提供了一種基于Northern雜交檢測家蠶 microRNA的方法，適合于鑒定家蠶miRNA和其他小RNA，而且 對其他物種的miRNA及其靶基因鑒定也有一定參考價值。

為了解決上述技術問題，本申請公開了一種基于Northern雜交檢 測家蠶microRNA的方法，包括以下步驟：

1)RNA的分離純化；

2)探針與Marker的放射性標記和標記產物純化；

3)制膠和電泳；

4)轉膜與RNA分子的交聯固定；

5)預雜交和雜交；

6)洗雜交膜和低溫放射自顯影；

7)雜交探針的剝脫與膜的再利用。

進一步地，RNA的分離純化具體按照以下步驟實施：

(1)180℃烘研缽2h，待冷卻至室溫后放于-20℃冰箱中預冷；

(2)分裝Trizol至1.5mL離心管中，1mL/支；

(3)將100μg家蠶組織材料在冰上研磨至白色粉末，需要加3 次液氮；

(4)將粉末轉到Trizol中，用移液槍槍頭吹吸數次至無明顯塊 狀，靜置5min；

(5)加入300μL氯仿，用力振蕩混勻20s，靜置10min；

(6)4℃條件下12000r/min離心20min，轉移上清液約600μL， 加入100μLPEG6000-NaCl混合溶液，15％PEG6000，2mol/LNaCl， 輕輕顛倒混勻，冰上靜置10min；

(7)4℃條件下10000r/min離心15min，將上層液體轉移到無 RNA酶的1.5mL離心管中，計量液體的體積；

(8)離心管中依次加入1/10體積的pH5.2、3mol/LNaAc、4μ LDNAmate，顛倒數次混勻，再加入2.5倍體積的無水乙醇，輕輕顛 倒數次混勻，-20℃靜置2h以上；

(9)4℃條件下13000r/min離心10min，小心將液體倒在廢液缸 中，用500μL75％乙醇洗沉淀1次，4℃條件下10000r/min離心2min， 倒掉液體，將殘留液體吸出；

(10)在無菌操作臺上將沉淀自然風干，時間為5min或在真空 干燥箱中干燥至微透明，時間為2min；