[發明專利]一種基于Northern雜交檢測家蠶microRNA的方法

在審

• 申請號: 201610184491.9
• 申請日: 2016-03-28
• 公開（公告）號: CN105695602A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 劉仕平;夏慶友
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 裴娜

1.一種基于Northern雜交檢測家蠶microRNA的方法，其特征 在于，包括以下步驟：

1)RNA的分離純化；

2)探針與Marker的放射性標記和標記產物純化；

3)制膠和電泳；

4)轉膜與RNA分子的交聯固定；

5)預雜交和雜交；

6)洗雜交膜和低溫放射自顯影；

7)雜交探針的剝脫與膜的再利用。

2.根據權利要求1所述的基于Northern雜交檢測家蠶microRNA 的方法，其特征在于，所述RNA的分離純化具體按照以下步驟實施：

(1)180℃烘研缽2h，待冷卻至室溫后放于-20℃冰箱中預冷；

(2)分裝Trizol至1.5mL離心管中，1mL/支；

(3)將100μg家蠶組織材料在冰上研磨至白色粉末，需要加3 次液氮；

(4)將粉末轉到Trizol中，用移液槍槍頭吹吸數次至無明顯塊 狀，靜置5min；

(5)加入300μL氯仿，用力振蕩混勻20s，靜置10min；

(6)4℃條件下12000r/min離心20min，轉移上清液約600μL， 加入100μLPEG6000-NaCl混合溶液，15％PEG6000，2mol/LNaCl， 輕輕顛倒混勻，冰上靜置10min；

(7)4℃條件下10000r/min離心15min，將上層液體轉移到無 RNA酶的1.5mL離心管中，計量液體的體積；

(8)離心管中依次加入1/10體積的pH5.2、3mol/LNaAc、4μ LDNAmate，顛倒數次混勻，再加入2.5倍體積的無水乙醇，輕輕顛 倒數次混勻，-20℃靜置2h以上；

(9)4℃條件下13000r/min離心10min，小心將液體倒在廢液缸 中，用500μL75％乙醇洗沉淀1次，4℃條件下10000r/min離心2min， 倒掉液體，將殘留液體吸出；

(10)在無菌操作臺上將沉淀自然風干，時間為5min或在真空 干燥箱中干燥至微透明，時間為2min；

(11)視沉淀量向離心管中加入50～100μL無RNA酶的甲酰 胺溶液，用移液槍槍頭將沉淀離散以助溶，于4℃條件下溶解沉淀30 min；

(12)取1～2μLRNA用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，電泳緩 沖液為l*TBE，100V；

(13)電泳期間吸取1.5μLRNA檢測濃度，以1.5μL甲酰胺作 對照；

(14)按照30μL/支將RNA進行分裝后，進行PAGE凝膠電泳 及后續操作，也可以加入500無水乙醇于-80℃保存備用。