[發明專利]基于核酸適體熒光探針AFP3的甲胎蛋白試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201610184376.1
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105785034B
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 張燕;夏昊強;周煌凱;陶勇;高川;馬衛紅;陳飛欽
• 申請（專利權）人: 廣州大學城健康產業科技園投資管理有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;G01N33/68
• 代理公司: 北京高航知識產權代理有限公司11530
• 代理人: 趙永強

技術領域

本發明屬于醫學檢驗測定技術領域，特別是涉及基于核酸適體熒光探針AFP3的甲胎蛋白試劑盒及其檢測方法。

背景技術

甲胎蛋白（AFP）是一種糖蛋白，正常情況下，這種蛋白主要來自胚胎的肝細胞，胎兒出生后約兩周甲胎蛋白從血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克/升。甲胎蛋白在產婦羊水或母體血漿中AFP可用于胎兒產前監測。如在神經管缺損、脊柱裂、無腦兒等時，AFP可由開放的神經管進入羊水而導致其在羊水中含量顯著升高。胎兒在宮腔內死亡、畸胎瘤等先天缺陷亦可有羊水中AFP增高。AFP可經羊水部分進入母體血循環。在85%脊柱裂及無腦兒的母體，血漿AFP在妊娠16-18周可見升高而有診斷價值，但必須與臨床經驗結合，以免出現假陽性的錯誤。

檢測甲胎蛋白的方法有好幾種，放射免疫法測得的甲胎蛋白大于 甲胎蛋白 500微克/升、且持續4周者，或甲胎蛋白在200～500微克/升、持續8周者，在排除其它引起甲胎蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌癥后，需再結合定位檢查，如B超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等即可作出診斷。不過，正常懷孕的婦女、少數肝炎和肝硬化、生殖腺惡性腫瘤等情況下甲胎蛋白也會升高，但升高的幅度不如肝癌那樣高。肝硬化病人血清甲胎蛋白濃度多在25～200微克/升之間，一般在2 個月內隨病情的好轉而下降，多數不會超過2個月；同時伴有轉氨酶升高，當轉氨酶下降后甲胎蛋白也隨之下降，血清甲胎蛋白濃度常與轉氨酶呈平行關系。如果甲胎蛋白濃度在 500 微克/升以上，雖有轉氨酶升高，但肝癌的可能性大，轉氨酶下降或穩定，而甲胎蛋白上升，也應高度懷疑肝癌。

甲胎蛋白在肝癌出現癥狀之前的8個月就已經升高，此時大多數肝癌病人仍無明顯癥狀，腫瘤也較小，這部分患者經過手術治療后，預后可得到明顯改善，故肝硬化、慢性肝炎病人、家族中有肝癌患者的人應半年檢測一次。

目前沒有能夠直接識別甲胎蛋白的抗體和其它分子探針。因此設計一種高度設別甲胎蛋白的分子探針，并基于此建立簡單快速和廉價的檢測方法將提高對肝癌和胎兒先天病等于甲胎蛋白相關的疾病的的監控。

核酸適配體是近年發展起來的一類新型識別分，是指能夠高特異性和高親和力地域靶分子結的單鏈核苷酸分子。核酸適體可以通過配體指數富集系統進化技術（Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment，SELEX）篩選獲得。SELEX 技術是指應用化學法合成大容量的隨機寡核苷酸(由兩端的固定序列和中間的隨機序列組成) 文庫,通過施加選擇壓力(結合靶目標，淘選與靶目標高度特異結合片段的過程), 并結合體外擴增技術, 經過多輪的循環選擇富集, 獲得與靶物質高度特異結合的寡核苷酸分子, 可以是RNA 也可以是DNA, 長度一般為25~ 60 個核苷酸。核酸適體主要通過發生適應性折疊，通過氫鍵、疏水堆積作用、范德華力與靶分子相互作用，與插入或包被的靶分子形成穩定的三維空間結構。核酸適體不與靶分子結合時，核酸適體處于比較松散的結構，5' 和3' 兩端相互游離。與靶分子結合時，靶分子誘導核酸適體結構發生改變，核酸適體的5' 端和3' 端都將參與與靶分子特定區域（類似于與抗體結合的抗原位點）的相互作用，導致5' 和3' 兩端相互靠近。這一特點使核酸適體適于分子信標探針設計。其中一種分子信標設計利用了熒光染料芘分子。當一個激發態芘分子和另一個基態芘分子近距離遭遇的時候能形成激發態二聚體，能在比芘單體波長更長的位置釋放一個光子。芘激發態二聚體發射峰在 480 到 500nm，而芘單體的發射峰在 370 到 400nm 之間。另外，芘分子熒光壽命比生物樣品中的非特異激發熒光的壽命長，檢測時可以在非特異激發熒光消失后，再來收集激發態二聚體的熒光信號，大大提高檢測的特異性和靈敏度。識別甲胎蛋白的核酸適體可以應用于甲胎蛋白的臨床檢測，提高檢測效率，降低檢測成本。

核酸適體與靶物質結合所呈現的高敏感性和高特異性, 使其在疾病診斷中具有良好的應用前景, 盡管目前成熟的臨床應用報道較少, 但應用適體檢測靶蛋白的研究卻不斷增多, 基于適體的檢測新技術也不斷出現。核酸適體由于其獨特的化學抗體特性成為新一代針對特定蛋白的分子藥物或靶向載體，以及用于檢測其特異性識別的靶分子物質。但是目前基于核酸適體的針對于甲胎蛋白AFP診斷試劑還很缺乏，且針對于甲胎蛋白AFP的核酸適體熒光探針檢測試劑盒的開發尚未見有報道。

發明內容