[發明專利]一種用于內耳毛細胞定向轉染的納米基因載體復合物及其制備方法

在審

• 申請號: 201610182762.7
• 申請日: 2016-03-28
• 公開（公告）號: CN107236760A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 吳南;楊仕明;王方園;鄧雄威;吳雁;陳志婷
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A61K48/00;A61P27/16
• 代理公司: 北京方安思達知識產權代理有限公司11472
• 代理人: 王宇楊,陳琳琳

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，特別是涉及一種用于內耳毛細胞定向轉染的納米基因載體復合物及其制備方法。

背景技術

感音神經性耳聾主要是由聽覺感受器官—耳蝸的變性引起的。對人類顳骨解剖學研究發現，感音神經性耳聾可由耳蝸多種細胞類型的變性引起，其中，承擔將聲音信號轉換為電信號的毛細胞病變，是目前針對感音神經性耳聾研究的核心問題之一。以往，研究者們認為在哺乳動物體內，耳蝸毛細胞損傷變性后是不可再生的。

近年來，有研究發現將包含毛細胞分化的關鍵基因---Atoh1基因的質粒導入體外培養的Corti器中，可以產生異位的毛細胞，本研究小組前期，利用腺病毒作為載體將Atoh1基因成功介導轉染至噪聲性聾的豚鼠耳蝸內，發現噪聲損傷的豚鼠耳蝸過表達Atoh1基因，可使受損耳蝸內產生大量新的內外毛細胞纖毛簇，促進聽功能的恢復。

既往關于將Atoh1基因及其同源基因轉入內耳的研究采用的基因載體大多為病毒類基因載體---腺病毒等。目前，常見的基因載體有病毒載體和非病毒載體兩大類。腺病毒載體屬于病毒載體的一種，具有較高的轉染效率，目前被廣泛應用。但病毒載體存在明顯的缺點，如可能誘導宿主免疫反應、存在潛在致癌性，制備條件復雜，細胞轉染缺乏特異性，且病毒載體所能裝載的外源DNA大小相對有限。此外，病毒載體導致的宿主基因重組是限制其臨床應用的另一個安全隱患。

因此，針對病毒載體的上述缺點，我們轉向非病毒載體的研究。非病毒制備簡單，載基因容量大，且不會誘發宿主的免疫反應。而納米顆粒又由于具備較高轉染效率及特異性靶向作用，以及部分可生物降解性、低毒性、無免疫原性等特點，是理想的基因載體選擇。其中，陽離子聚合物載體具有良好的結合和保護DNA的能力，易制備成納米顆粒，能較易實現生物靶向性及生物適用性改造，是目前基因非病毒載體的一個重要研究對象。

既往關于內耳非病毒基因載體的研究發現了數個能實現有效內耳基因轉染的陽離子聚合物納米顆粒載體，如Wu N等研制了一種基于PAMAM的羧甲基β-環糊精分子修飾聚酰胺胺納米載體攜帶Atoh1基因，通過圓窗膜途徑將復合物導入內耳， 術后7天發現內毛細胞的轉染效率可達47.57±6.68％，外毛細胞的轉染效率則可高達82.14±9.67％，實現了Atoh1基因向大鼠耳蝸的成功遞送。但PAMAM衍生物合成過程復雜，制備過程可控性較差，合成產物穩定性不佳，因此無法進行進一步的推廣，且既往的內耳轉染研究均未報道能實現針對于毛細胞的定向轉染。

因此，我們選擇了聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)。PEI是目前最熱門的非病毒基因載體材料之一，也是目前最為廣泛研究的陽離子聚合物基因載體材料，在體外具有較高的轉染效率。在結構上，PEI可分為直鏈型(linear Polyetherimide,lPEI)和分支型(branched Polyetherimide,bPEI)兩種結構。以往大部分的實驗研究均采用分支型PEI，其內含有大量的伯仲叔三種氨基，質子緩沖區間大，即具有獨特的“質子海綿效應”，在PEI-DNA納米復合物通過內吞作用進入細胞后，在溶酶體內逐漸累積，致使溶酶體的滲透性逐漸增強，在無需溶酶體溶解肽輔助作用下即可使溶酶體破裂，釋放內吞的DNA至胞質。然而，PEI等合成型陽離子聚合物都有一定的毒性，其基因轉染效率和毒性與其分子量有關。高分子量的PEI(如25kDa PEI)，帶有較多的正電荷，因此具備較高的結合DNA的能力，而具有較高的轉染效率，但因PEI在體內不可降解，因此過高的電荷密度也導致較大的細胞毒性，在體內應用受到限制。低分子量PEI(如<2kDa PEI)毒性較小，但所帶的正電荷也少，不能有效結合及完全包裹DNA，載體穩定性差，轉染效率也不高。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術中的問題，提供一種新的納米基因載體復合物及其制備方法，該方法合成過程易操作、穩定性強、可實現內耳毛細胞的定向轉染，達到治療受損毛細胞的目的。

本發明為了解決上述技術問題，所采取的技術方案為：

本發明提供了一種用于內耳毛細胞定向轉染的納米基因載體復合物，其中，所述納米基因載體復合物包括由透明質酸修飾的PEI載體以及由所述載體運載的Atol1基因。

作為優選地，本發明所述的PEI載體為25kDa的bPEI納米顆粒。

本發明選擇的目的基因為可以任意動物的來源的Atoh1基因，例如，小鼠、大鼠、兔和豬等動物的Atoh1基因以及人的Atoh1基因，具體來源根據實際需要選擇。