[發明專利]瘧疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR分子檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201610181822.3
• 申請日: 2016-03-28
• 公開（公告）號: CN105695601B
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: 江莉;蔡黎;張耀光;王真瑜;朱民;馬曉疆;吳寰宇
• 申請（專利權）人: 上海市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 王潔

本發明涉及一種瘧疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR分子檢測試劑盒及其檢測方法，其中試劑盒包括混合引物組合、2×多重PCR預混液、多重PCR陽性參考、100bp分子量Marker，所述的混合引物組合包括引物序列為No.1～SEQ ID No.10的特異性嵌合引物和1條序列為SEQ ID No.11的通用引物；所述的檢測方法包括多重PCR擴增反應，其中循環溫度為58℃、62℃和68℃三個逐級遞增的退火溫度循環。采用該種瘧疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR分子檢測試劑盒及其檢測方法，通過SEQ ID No.1～11所示引物序列的組合，一次PCR反應就可對瘧疾樣本中的特異性種和屬基因片段同時進行擴增，根據擴增片段的大小和組合就可以對4種瘧原蟲進行鑒別診斷。節省時間和人力物力，提高檢測效率。

技術領域

本發明涉及醫藥試劑領域，尤其涉及基因診斷試劑盒，具體是指一種瘧疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR分子檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

瘧疾(malaria)是由瘧原蟲感染引起的危害嚴重的寄生蟲病。感染人類的瘧原蟲主要有4種：惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum，Pf)、間日瘧原蟲(P.vivax,Pv)、三日瘧原蟲(P.malariae，Pm)和卵形瘧原蟲(P.ovale，Po)。據WHO最新數據，在全球范圍內,有97個國家和地區的大約33億人處在瘧疾感染及其引發的其他疾病的風險中。2013年全球瘧疾病例為1.98億，導致58.4萬人死亡。其中，90％的死亡病例發生在非洲地區，5歲以下的兒童占所有死亡的78％。在我國，目前瘧疾的疫情形勢已經發生了明顯的變化，瘧疾報告病例主要以輸入性病例為主，境外輸入性病例高達97％以上。由于境外輸入地來源廣泛，各種瘧疾都有報告，呈現出以惡性瘧為主，間日瘧、卵形瘧和三日瘧次之，混合感染和新型瘧疾諾氏瘧原蟲感染也占有一定比例的復雜態勢。如何快速而準確發現感染者，是對瘧疾檢測和診斷技術提出的新要求。

瘧原蟲檢測的常用技術有顯微鏡檢查、免疫學檢測和分子生物學檢測。對于疑似瘧疾的患者，WHO推薦的方法是用顯微鏡檢查和以免疫層析技術為主的瘧疾抗原免疫學檢測(RDT)。傳統的厚薄血膜鏡檢仍然是實驗室檢查瘧原蟲的“金標準”，檢出敏感性一般為50個蟲/μl。在瘧疾監測中，人群帶蟲率低，加上瘧區普遍服用抗瘧藥物而影響了原蟲的正常形態，導致鏡檢所耗費的人力較大，對鏡檢技術的要求也更高。RDT檢測方法雖然具有快速、簡單和方便使用的優點，但是也存在不同產品的檢測閾值和現場穩定性差異較大，檢測敏感性不高(200個蟲/μl)和不能進行蟲種鑒別等不足。因此，建立能夠替代傳統鏡檢的敏感、特異、簡便和可批量檢測的方法甚為必要。

以PCR為代表的分子檢測技術是迄今在瘧疾診斷中敏感性和特異性最高的檢測技術。檢測的目標基因包括瘧原蟲基因組DNA、18S小亞基rRNA、二氫葉酸還原酶、線粒體基因組、細胞色素b、環子孢子表面蛋白等。常用的方法有常規PCR、巢式PCR、半巢式PCR、熒光定量PCR、環介導等溫擴增(LAMP)、多重PCR等多種。各種PCR方法檢測瘧原蟲的靈敏度一般都可以達到10～1個原蟲/μl。但各種方法所需的儀器設備、試劑材料及操作流程不同。在實際應用中，由于成本效益、操作復雜性、人員培訓及準確快速等方面顯示了較大差異，使得有些方法并不適于推廣應用。如常規PCR，使用常規儀器設備，“一步式”反應程序，操作簡單。但一次反應只能進行一個目的基因的擴增，對于有多個蟲種的瘧原蟲診斷并不適用；巢式PCR可以進行多個蟲種的鑒別，但需要進行2輪PCR反應，每輪反應需要多個反應才能完成，耗時費力。熒光定量PCR，敏感性較高，但儀器設備及試劑成本也高，不利基層使用。LAMP無需特殊設備，肉眼即可觀察結果，但是不能進行蟲種鑒別。多重PCR可以克服上述方法的缺點，一次反應即可擴增多個目的基因，普通的熱循環儀就可以完成，是近年來逐漸成熟的新技術。

發明內容

本發明的目的是克服了上述現有技術的缺點，提供了一種能夠同時進行瘧原蟲種和屬特異性分析的瘧疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR分子檢測試劑盒及其檢測方法。